Transformación plastidial de maíz: obtención de regeneraciones heteroplásmicos
- Autores: Susana Martin Ortigosa
- Directores de la Tesis: Jon Veramendi (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Torne Cubiro (presid.), Inmaculada Farran Blanch (secret.), Ana Maria Castillo Alonso (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El maíz es uno de los cereales de mayor consumo en alimentación humana y animal. El crecimiento de la población, el mayor consumo de carne de los países con economías emergentes, su uso como biocombustible o el cambio climático hacen que se necesite aumentar la productividad de este cultivo. La biotecnología vegetal ofrece distintas herramientas para poder lograr ese objetivo, siendo una de ellas la transformación plastidial. Esta técnica posee ventajas muy importantes como la alta expresión de la proteína heteróloga y evitar la dispersión vía polen de los transgenes a otros cultivos debido a la herencia materna de los plastidios. Poner a punto la técnica de transformación plastidial de maíz permitiría trasladar estas ventajas a este cultivo tan importante.
Para transformar plastidialmente el maíz se pusieron a punto varios protocolos de cultivo in vitro de distintos explantos y líneas de maíz con el objetivo de encontrar el más apto para su transformación. A excepción del cultivo de cúmulos de ápices, el protocolo de regeneración más eficiente fue por embriogénesis somática a partir de embriones inmaduros. Se logró además cultivar callo embriogénico en condiciones de luz empleando la hormona peptídica PSK- alfa - realizar una doble ronda de selección cultivando embriones somáticos maduros y cultivar agregados celulares de callo como alternativa a las suspensiones embriogénicas.
Los sistemas de selección basados en antibióticos fueron tres: el gen marcador aadA y estreptomicina, el gen nptII y kanamicina y el gen Aph(4) y la higromicina. Estos genes se introdujeron en 4 vectores distintos que insertaron los transgenes en las zonas de la región repetida invertida del plastoma 16S ARNr-trnV-ORF85/ORF58 ó 16S ARNr-trnI/trnA-23S ARNr. Se realizaron un total de 54 experimentos de transformación de 12 tipos de materiales distintos y se obtuvieron un total de 1.738 regenerantes de los cuales 7 fueron regenerantes transplastómicos con un alto grado de heteroplasmia. Seis fueron obtenidos seleccionando con estreptomicina y 1 con higromicina.
Se diseñó un sistema de selección alternativo al empleo de antibióticos basado en el restablecimiento del fenotipo de los mutantes fotosintéticos albinos nucleares csr1-1, crs1-2 y crs2-2. Se consiguió obtener callo embriogénico homocigótico mutante cultivado en luz y en oscuridad a partir de embriones inmaduros. El gen mutado de cada mutante se introdujo en un vector de transformación plastidial que tiene la zona de recombinación 16S ARNr-trnI/trnA-23S ARNr con el que se realizaron 6 experimentos de transformación de los cuales no se obtuvieron regenerantes.
