Caracterización de los sistemas de Quorum Sensing en rizobios. Importancia durante el dialógo molecular en la simbiosis rizobio-leguminosa.
- Autores: Francisco Pérez Montaño
- Directores de la Tesis: Ramón Andrés Bellogín Izquierdo (dir. tes.), María del Rosario Espuny Gómez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mª Belen Rodelas Gonzalez (presid.), Francisco Javier López Baena (secret.), María Sánchez Contreras (voc.), Eulogio J. Bedmar (voc.), Francisco Javier Lloret Romero (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
Título del trabajo: Caracterización de los sistemas de Quórum Sensing en rizobios. Importancia durante el diálogo molecular en la simbiosis rizobio-leguminosa.
INTRODUCCIÓN El ¿Quorum Sensing¿ (QS) es un proceso dependiente de densidad celular en el que se producen y secretan unas moléculas extracelulares difusibles denominadas autoinductores (AI). Cuando se alcanza una concentración umbral, estas moléculas entran de nuevo en la célula y coordinan la expresión de ciertos genes. En las bacterias Gram negativas el grupo de AIs más importante son las N-acil homoserina lactonas (AHLs). Dentro de la familia Rhizobiaceae, los genes regulados por QS están implicados en mayor o menor medida en la simbiosis con la leguminosa: la transferencia de plásmidos, la movilidad bacteriana, la formación de biofilm, etc. Las plantas, a su vez, también pueden producir moléculas de diversa naturaleza química que interfieren en los sistemas de QS de estas bacterias, potenciándolos o inhibiéndolos.
MATERIALES Y MÉTODOS Para la determinación del perfil de AI y cuantificar las diferencias en la producción total de AI producidos por las bacterias en estudio en diferentes condiciones (Sinorhizobium fredii SMH12, Rhizobium etli ISP42 y Rhizobium sulle IS123) se llevaron a cabo ensayos de difusión en placa, cromatografía en capa fina, HPLC acoplada a espectrometría de masas y ensayos con de inducción en placa microtítulo. Para algunos de estos ensayos se usaron biosensores bacterianos, que detectan con distinta sensibilidad las diferentes AHL: Agrobacterium tumefaciens NT1 (pZRL4), Escherichia coli JM109 pSB536 y Chromobacterium violaceum CV026.
Se estudiaron también diferentes aspectos de la simbiosis rizobio-leguminosa mediante ensayos de nodulación, de movilidad bacteriana, de formación de biofilm y de colonización dela raíz. Paraello, entre otras técnicas, se empleó la microscopía de epifluorescencia, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido.
Además de todo lo descrito, a lo largo de este trabajo se han realizado numerosas PCR, digestiones de ADN mediante enzimas de restricción, actividades enzimáticas, y otras técnicas de microbiología clásica.
Para los ensayos de detección y caracterización de moléculas que interfieren en los sistemas de QS producidas por plantas de arroz y judía se llevaron ensayos similares a los realizados en los estudios de los perfiles de AHL de las bacterias estudiadas.
RESULTADOS 1. Sinorhizobium fredii SMH12, Rhizobium etli ISP42 y Rhizobium sulle IS123 producen como moléculas AI la C8-HSL y al menos uno de sus derivados oxo- o hidroxi-. SMH12 y ISP42 producen además la C14-HSL y la 3-oxo-C14-HSL, respectivamente.
2. S. fredii SMH12 posee al menos tres genes de síntesis de AHL: traI, implicado en la síntesis de la 3-oxo-C8-HSL, traI(2) y sinI. R. etli ISP42 posee al menos dos genes de síntesis de AHL: raiI, implicado en la síntesis de la C8-HSL y la 3-OH-C8-HSL.
3. En Sinorhizobium fredii SMH12, Rhizobium etli ISP42 y Rhizobium sulle IS123 la presencia de flavonoides inductores de los genes de nodulación (genisteína, apigenina y daidzeína respectivamente) y no así los flavonoides no inductores (umbeliferona para SMH12 e ISP42, y apigenina para IS123) incrementan la producción total de AI y la expresión de los genes de síntesis de AHL: traI de SMH12 y raiI y cinI de ISP42.
4. En S. fredii SMH12 la expresión de traI está reprimida por NodD1. En presencia del flavonoide inductor de los genes de nodulación NodD1 deja de reprimir la expresión de traI. La presencia de la lactonasa [SMH12 (pME6863)] inhibe el incremento de expresión del gen traI en presencia del flavonoide inductor.
5.La estirpe SMH12 (pME6863), que expresa la enzima lactonasa, posee un menor número de nódulos que la estirpe silvestre en la simbiosis con la soja cv Osumi.
6. La pérdida de AHL en SMH12 por la expresión del gen que codifica por la lactonasa [SMH12 (pME6863)] no altera la producción de otras moléculas simbióticamente importantes: exopolisacáridos, lipopolisacáridos y proteínas Nop.
7. La formación de biofilm en la estirpe silvestre S. fredii SMH12 cambia de tipo monocapa, cuando no se suministra flavonoide, a de tipo microcolonia, cuando se suministra genisteína en el medio de cultivo. Enla estirpe SMH12 (pME6863) esta transición en el tipo de biofilm no se completa, quedándose en un estado intermedio entre biofilm de tipo monocapa y de tipo microcolonia.
8. S. fredii SMH12 (pME6863) no coloniza eficientemente la raíz de la soja cv Osumi, localizándose únicamente en las zonas cercanas al punto de inoculación, ya que apenas colonizan el ápice de la raíz y las raíces laterales.
9. Las plantas de arroz cv Puntal y judía cv BBL producen al menos un tipo de molécula que interfiere en los sistemas de QS bacterianos. Estas moléculas no son de tipo N-acil homoserina lactonas.
DISCUSIÓN Las tres bacterias poseen un perfil de producción de AI similar. Sin embargo, el rango de nodulación en ellas es diferente: Sinorhizobium fredii SMH12, que es un rizobio con amplio rango de hospedador; Rhizobium etli ISP42, que nodula en varias leguminosas y Rhizobium sullae IS123 que sólo se ha demostrado que nodula en la leguminosa Hedysarum coronarium. Además, tras identificar a los mejores flavonoides inductores de los genes de nodulación en cada bacteria, se constató que éstos juegan un papel importante en la producción de AI por los rizobios. Esto sugiere que las leguminosas podrían modular la producción de señales de QS que directamente regularían factores implicados en el inicio dela simbiosis. De hecho, los flavonoides inductores seleccionados para cada rizobio son producidos por sus respectivas plantas hospedadoras.
En S. fredii SMH12, para una simbiosis eficiente, parece clave que se produzca una correcta colonización de la raíz de la soja por la bacteria. Para que se colonice toda la raíz de la leguminosa serían necesarios los sistemas de QS bacteriano, ya que están implicados en movilidad de tipo swimming y, sobre todo, en la formación de biofilm de tipo microcolonia que se da únicamente en presencia de flavonoides específicos de los genes de nodulación, esto es, enla rizosfera. Ambos procesos son necesarios para la colonización de todas las zonas de la raíz.
Los estudios de detección e inicio de caracterización de moléculas que interfieren en los sistemas de QS bacteriano realizados en la Tesis parecen indicar que las moléculas producidas por plantas de arroz y judía que interfieren en los sistemas de QS bacteriano no son de tipo AHL y, sin embargo, son capaces de activar o inhibir estos sistemas en diferentes estirpes biosensoras. Por ello, probablemente las plantas produzcan a través de sus exudados varias moléculas capaces de interferir específicamente en los sistemas de QS, potenciando unos e inhibiendo otros, como primera línea de defensa de la planta.
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