Resumen de Estudio teórico de los complejos de michaelis que forma la enzima lipoxigenasa 15 de mamíferos con el ácido araquidónico y el ácido linoleico
Las lipoxigenasas se definen como una familia de enzimas, denominadas dioxigenasas, que contienen un grupo de hierro no-hémico, y que son las encargadas de catalizar la adición de oxígeno molecular a ácidos grasos poliinsaturados que presenten la estructura (Z,Z)-1,4-pentadieno, generando como productos los hidroperóxidos correspondientes. De esta reacción experimentalmente se ha determinado en la lipoxigenasa de soya, que el paso limitante de la velocidad es la abstracción de hidrógeno desde el sustrato al cofactor, la molécula de OH-. Además se ha demostrado experimental y teóricamente la gran importancia del efecto túnel en este proceso de transferencia de hidrógeno. Las lipoxigenasas, de manera estructural se pueden definir como macromoléculas divididas en dos dominios, o secciones estructurales; el primero denominado ¿barril beta¿ debido a que las estructuras de láminas beta adoptan la forma de un barril; y un segundo llamado zona de las hélices alfa, en la cual se encuentra ubicado el sitio activo de la enzima. En el sitio activo de las lipoxigenasas se ubica el átomo de hierro, el cual se encuentra coordinado a 5 residuos de la proteína y al cofactor, la molécula de OH- . En el caso de la lipoxigenasa 15 de mamíferos (especie conejo) 15-rLO-1, la coordinación adopta una geometría aproximadamente octaédrica. Esta enzima reviste un desafío para el estudio teórico, debido a las peculiaridades que presenta, la principal es que no es selectiva al sustrato, ni a la posición de oxidación, pudiendo liberar, como producto de la reacción en diferente proporción 15-HPETE y 12-HPETE, siendo el principal el 15-HPETE. Debido a la poca certeza a la forma en que el sustrato se posiciona en el centro activo de la enzima, es que se plantea que es éste uno de los factores que definen la doble especifidad de la 15-rLO-1. Por otra parte se plantea que es el volumen de la cavidad el otro factor que determina su doble especificidad. Se planeta que las lipoxigenasas de mamífero pueden oxidar el ácido graso libre o esterificado, por lo que se presume que el terminal carboxilato debería estar orientado hacia la superficie de la cavidad del centro activo. A esta conformación se le ha denominado ¿derecha¿ ó ¿cola primero¿, ésta última definición de cola, es referida a la cadena hidrocarbonada del sustrato. Quienes apoyan esta teoría, además argumentan que posicionar el terminal carboxilato (cargado) en un ambiente hidrofóbico, como lo es la cavidad del centro activo, impone una restricción que oscilaría entre las 12 y las 30 kJ/mol. Sin embargo la 5-LO presenta la orientación ¿inversa¿ ó ¿cabeza primero¿, refiriendo la cabeza al terminal carboxilato del ácido graso, por lo que no podría oxidar la especie esterificada. Por otra parte la 8-LO, pese que en un comienzo se pensó era del tipo ¿inverso¿ como la 5-LO, un estudio posterior ha propuesto una nueva conformación para esta enzima. Se ha observado la existencia de efectos alostéricos en 15-hLO-1 (espécie húmana). Estos experimentos muestran como la unión de una molécula efectora (el producto de la reacción por ejemplo) en un sitio alostérico, definido genéricamente, puede cambiar la especificidad de la enzima y las contribuciones en la constante de velocidad de los pasos individuales en el mecanismo catalítico. Destacan así mismo, la posibilidad de que este hecho sea un mecanismo auto-rregulatorio, que podría relacionar los diferentes tipos de lipoxigenasas. Para el caso de la 15-rLO-1, no se dispone de una estructura cristalográfica del complejo enzima:sustrato, sin embargo durante la cristalización de la estructura revisada de la enzima, se definió que es una estructura dimérica y que la molécula posicionada en el sitio activo de uno de los monómeros, podría ser la responsable de inducir el cambio conformacional, que permite caracterizar el monómero con el inhibidor, como la estructura cerrada y el otro monómero como la estructura abierta. El interés sobre este sistema, es debido a los resultados obtenidos en animales, y su papel en la génesis de la enfermedad de ateroesclerosis, y su rol en humanos. Otras investigaciones la relacionan con el cáncer de próstata, colorrectal y de mamas. En general los estudios presentan como prueba la presencia de esta enzima y grandes cantidades de células espumosas en los tejidos atrofiados que se detectan en el inicio de la enfermedad. Las células espumosas se forman a partir de anticuerpos que han intentado de manera fallida digerir moléculas de lipoproteínas (específicamente LDL, Light Density Lipoproteín) ligeramente oxidadas, cuyo componente principal es el ácido linoleico (LA). Sumando la capacidad de la 15-LO de oxidar el LDL, a su presencia en los tejidos dañados, se presumen sea la responsable de la oxidación de la molécula que dio paso a las células espumosas y en etapas posteriores de la enfermedad al tejido detectado, llamado ateroma. Otros estudios en animales demuestran que la inhibición de esta enzima entrega especies con menos lesiones por ateroesclerosis.
En la predicción teórica inicial del complejo de Michaelis, se combinaron las técnicas de docking, para evaluar la flexibilidad del sustrato y mecánica molecular, para evaluar el ajuste de la proteína. Se estudiaron los dos sustratos fisiológicos de la enzima, el ácido araquidóncio (AA) y ácido linoleico (LA) de manera paralela y siguiendo los mismos protocolos de estudio. En las simulaciones se utilizó en un primer acercamiento y conducente a los resultados de los estudios del titulo de máster, como método de solvatación, la técnica de solvatación estocástica, que simula una esfera de agua en torno al centro activo, y que reduce significativamente los tiempos de simulación, frente al método periódico, que fue el método utilizado durante la mayoría de las simulaciones de mecánica molecular, y en el cual se simula una caja de solvatación sobre toda la enzima, que se replica de manera periódica y al infinito, mejorando así la descripción del ambiente de solvatación en la cual se encuentran las enzimas. Las simulaciones de dinámica molecular se analizaron en términos estructurales, y de todas ellas, enzima nativa y especies mutantes, se obtuvo valiosa información en términos de conformaciones del sustrato y residuos de contorno de la cavidad. Una vez analizados estos resultados se realizaron cálculos de redocking para evaluar si se mejoraban los resultados que pudiesen ser reactivos, y viables para el siguiente paso, los estudios de reactividad. Los cálculos de crosdocking, consideraban las mismas estructuras evaluadas para el redocking, pero cruzando el sustrato, así en los complejos enzima:AA, se volvían a realizar cálculos de docking con LA, para evaluar la existencia de ajuste selectivo entre la enzima y sus dos sustratos fisiológicos. Como etapa final, algunos complejos que en términos estructurales parecían reactivos, fueron seleccionados para los estudios de reactividad, mediante métodos de cálculo denominados híbridos QM/MM, de sus siglas en inglés. En estos estudios se busca la minimización inicial del complejo, mediante el cálculo combinado que utiliza un método de mecánica cuántica para la parte QM y una simulación de mecánica molecular para el resto del sistema. Debido a la complejidad que implica la descripción electrónica del átomo de hierro, se utilizaron diversas interfaces para la consecución de este objetivo. Para la parte MM se utilizó CHARMM versión c35 en interface con los programas MNDO97, Qchem y Chemshell, que nos permitieron la evaluación de diversos métodos de cálculo electrónico. Hacia el final de la investigación, la colaboración con un grupo experimental nos planteó el estudio teórico del mismo sistema enzima:AA en la especie dimérica de la enzima, tanto nativa como mutantes de la misma, para las cuales se emplearon los protocolos de simulación de dinámica molecualr utilizados con anterioridad, sumados además la cuatificación y análisis del cambio en la superficie de contacto entre los monómeros.
Se obtuvieron diversos complejos pre-catalíticos de Michaelis para los complejos 15-rLO-1 con sus dos sustratos fisiológicos, ácido araquidónico y ácido linoleico. Algunos de ellos describen de manera preliminar el hecho de la doble especificidad que presenta esta enzima, cuando el sustrato es ácido araquidónico, sin embargo corroborar este hecho mediante cálculos de reactividad, es una alternativa de investigación a futuro.El estudio estructural de las diversas simulaciones, nos permitió discriminar entre las propuestas que existían sobre el posicionamiento del sustrato, descartándose en base a nuestros resultados la orientación inversa para el ácido araquidónico. Diferentes residuos fueron analizados a lo largo de la investigación, debido a su presencia en estudios experimentales, sin embargo el rol de la Arg403, fue el más estudiado por nosotros. Se presumió en un primer momento que quizás la forma en la que se orientan mutuamente al formar el complejo (terminal carboxilato del sustrato y cadena lateral de Arg403), sería la responsable de la doble especificidad de la enzima, hecho que fue descartado a la luz de los resultados. Sin embargo su rol en el anclaje se demostró en los presentes modelos, corroborando los resultados experimentales.A pesar de que se señala que la cavidad de la 15-LO-1 es una de las más pequeñas en referencia a la 12 y 5-LO, la flexibilidad de la proteína, ante las diversas conformaciones del sustrato, nos permitió determinar que se adapta y cambia. En este movimiento de ajuste complementario entre el sustrato y la enzima, la cavidad permite que el sustrato cambie significativamente en términos rotaciones y trasnacionales, durante la fase de producción. La flexibilidad de esta enzima no es un hecho tan sólo a nivel local, se observaron durante algunas simulaciones, movimientos de estructura secundaria e interdominio, que no fueron cuantificados en el monómero. El ó los motivos de los movimientos de la estructura secundaria (¿- hélice 2), fueron sistemáticamente analizado, en términos estructurales, en todas las simulaciones, llevándonos a la conclusión de que son una serie de residuos a la entrada de la cavidad, los que participan en los movimientos de apertura y cierre de la cavidad, entre los que se encuentran, Arg403, Asp 174, Phe 175 y Glu176, sin olvidar las interacciones con el sustrato.El estudio de los sistemas diméricos, abrió hacia finales de la investigación, un nuevo campo de estudio a nivel estructural. El hecho de que la disrupción de la interface mediante mutaciones afectara la capacidad catalítica de la enzima, es un hecho interesante, tomando en cuenta que hasta el momento sólo se consideraba su actividad como monomérica. Mediante los resultados de nuestras simulaciones, se puede concluir que las mutaciones afectan a la interface de la enzima, de forma tal que la superficie de la interface de reduce, lo cual fue cuantificado. Pese a este hecho, ser concluyentes respecto al rol dimérico de ésta enzima en base a los resultados aquí presentados, sería incorrecto
