Caracterizacion molecular del microambiente de la piel en pacientes con vitiligo, para la búsqueda de biomarcadores indicadores de respuesta a tratamiento.

• Autores: Jorge Ocampo Candiani
• Directores de la Tesis: Juan José Vilata Corell (dir. tes.), Rocío Ortiz López (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2016
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Luis Alfonso Sánchez (presid.), Jose Carlos Armario Hita (secret.), Osvaldo Tomás Vázquez Martínez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Dermatología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RODERIC
• Resumen

  • "El vitiligo pertenece a una familia de enfermedades cutáneas congénitas o adquiridas, caracterizadas por falta de pigmentación en la piel en forma de máculas bien definidas, acrómicas o hipocrómicas, en las cuales se ha observado el deterioro de la función del melanocito, la célula de la piel encargada de la producción de la melanina. Aunque se ha descrito que esta enfermedad afecta entre el 0.1 y el 2% de la población mundial, su prevalencia varía considerablemente entre la población o grupo étnico analizado. Las causas del vitiligo son complejas y aún no se han comprendido en su totalidad. Varias hipótesis han sido desarrolladas para explicar el proceso de despigmentación, o incluso la destrucción del melanocito. Sin embargo, no dan cuenta del completo espectro de esta enfermedad. Los estudios realizados a la fecha se han enfocado en estudiar la importancia del melanocito como productor de pigmento y describir cómo las alteraciones en el mismo tienen como consecuencia el desarrollo del vitiligo. Sin embargo, en su mayoría estos han sido realizados a través de métodos de cultivo celular, lo que puede alterar los patrones de expresión reales de la célula, en comparación con los presentes en su tejido de origen, por lo que el estudio del microambiente de la piel y el análisis del estado funcional de sus componentes celulares, pueden ayudar a determinar la mejor alternativa terapéutica en la repigmentación. Objetivo: Identificar en la piel de pacientes con vitiligo antes y después de ser sometidos a tratamiento con fototerapia UVB-nb, cambios en patrones de expresión de genes con utilidad pronóstica. Material y Método: Estudio comparativo, prospectivo, ciego con respecto al evaluador, experimental y longitudinal. Una vez obtenido el consentimiento informado, fueron incluidos cuarenta y cinco sujetos con Vitiligo Vulgar (21 sexo Femenino y 24 sexo Masculino; 23 con forma activa del vitiligo vulgar y 22 con su forma estable), provenientes del Estado de Nuevo León, México, que asistieron al Servicio de Dermatología del Hospital Universitario José Eleuterio González (HUJEG), de la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL), Monterrey (MTY), Nuevo León, México. Previo al tratamiento se obtuvieron muestras de sangre para realizar pruebas bioquímicas en el Laboratorio Central y en el Servicio de Endocrinología del Hospital Universitario UANL. Además, se tomaron 2 biopsias de piel en sacabocado de 4 mm en cada paciente, correspondientes a piel lesionada y piel sana respectivamente. Posteriormente fue iniciado el tratamiento utilizado el equipo de fototerapia UVB-nb en cada paciente, 2 veces por semana, 48 sesiones totales. Al finalizar el protocolo se tomaron biopsias controles, una en tejido repigmentado y otra en el tejido que no experimentó respuesta al tratamiento. Las biopsias de piel fueron utilizadas para extraer ARNm mediante RNaeasy MiniKit de QIAGEN, El cual fue cuantificado y utilizado para realizar el análisis de expresión mediante RNA-Seq (análisis de expresión mediante secuenciación masiva de ARN), en genes participantes en las rutas de pigmentación de la piel, apoptosis, estrés oxidativo, traducción de señal y sobrevida celular, con la finalidad de identificar cambios asociados con el estado de la piel del paciente con utilidad pronóstica de tratamiento. Los análisis moleculares y perfiles de expresión de la biopsias de piel fueron realizados en la Unidad de Biología Molecular, Genómica y Secuenciación (UBMGyS) del Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias de la Salud (CIDICS) UANL, MTY, México. Los resultados clínicos de respuesta a tratamiento fueron evaluados por 2 investigadores independientes y cegados a los resultados de la secuenciación masiva de RNA mediante TruSeq de las muestras de piel. Finalmente, el análisis estadístico de los niveles de expresión y su relación con los parámetros clínicos, bioquímicos y respuesta a tratamiento, fue realizado mediante R de Bioconductor, SPSS y BaseSpace de Illumina Resultados: Se observó que la mayoría de los pacientes desarrollan la enfermedad antes de los 30 años, y que el desarrollo de la patología tenía relación con antecedentes heredofamiliares de la patología u otras de naturaleza inmune. La correlación entre los resultados clínicos, bioquímicos y de expresión permitió identificar que bajos niveles de TSH, y un elevado peso en los pacientes puede conducir a una pobre respuesta al tratamiento UVB-nb. Por otra parte, el análisis de expresión permitió detectar diferencias significativas en los patrones de expresión de los genes DCT, MLANA y TYRP1 en la piel que presentó pigmento (normal y repigmentada), en comparación con su contraparte despigmentada (piel con vitiligo y que no repigmentó después de tratamiento). Además, se obtuvo un grupo de genes con utilidad predictiva para respuesta a tratamiento, relacionados con la pigmentación (DCT y TYRP1), y con la respuesta al estrés oxidativo (CCBL2 y GPD1); por otra parte, si se considera el tipo de vitiligo vulgar de acuerdo a su progresión de la enfermedad como factor determinante en la respuesta a tratamiento, el gen MC1R, puede ser de utilidad para diferenciar la respuesta entre grupos activos y estables. Finalmente, el análisis utilizando la aplicación TruSeq Targeted RNA de Illumina sugiere a los genes participantes en la pigmentación de la piel (DCT, TYRP1 y MLANA), regulación del estrés oxidativo (GPD1), apoptosis (CSNK1G3, BAX, BCL3 CFLAR, CASP7 y CASP8) y la ruta de las MAP Cinasas (MAPK1) relacionada con la proliferación y diferenciación celular, como potenciales marcadores moleculares con utilidad pronostica de respuesta a tratamiento. Financiamiento: Este proyecto contó con financiamiento del “Programa de Apoyo a la Investigación Científica y Tecnológica” (PAICyT - UANL) con número CS879-11, y de recursos propios del Servicio de Dermatología, Hospital Universitario Dr. José Eleuterio González, UANL, MTY, Nuevo León México. Vitiligo belongs to a family of skin or acquired congenital diseases, characterized by a lack of pigmentation in the skin as macules or well-defined spots, a chromic or hypo chromic, in which there has been the deterioration of the function of melanocytes, the skin cell responsible for melanin production. Although it has been reported that this disease affects between 0.1 and 2% of the world population, its prevalence varies considerably among the population or ethnic group analyzed. The causes of vitiligo are complex and have not yet been fully understood. Several hypotheses and theories have been developed to explain the process of depigmentation, or even destruction of melanocytes that occurs in this pathology. However, it does not explain the full spectrum of this disease. Studies to date have focused on analyzing the importance of the melanocyte as the producer of pigment and describe how alterations in it have resulted in the development of vitiligo. However most of these have been made by cell culture methods, which can alter the actual cell expression patterns, in comparison to the ones present the tissue of origin, there for the study of the skin’s microenvironment and analysis of the functional status of cellular components can help determine the best therapeutic alternative in repigmentation. Objective: To identify on the skin of vitiligo patients before and after undergoing phototherapy with UVB-nb, changes in patterns of gene expression with prognostic value. Population and Methodology: Comparative, prospective, blinded to assessor, experimental and Longitudinal Study. Forty-five subjects with Vitiligo Vulgaris (21 females and 24 males; 23 with active form of vulgar vitiligo and 22 with its stable form) from the State of Nuevo Leon, Mexico, who attended the Dermatology Department of the University Hospital Jose Eleuterio Gonzalez of the Universidad Autonoma de Nuevo Leon (UANL), Monterrey (MTY), Nuevo Leon, Mexico, after signing the informed consent, underwent treatment UVB-nb. Prior to treatment, blood samples were obtained for biochemical tests at the Central Laboratory and also at the Department of Endocrinology, Hospital Universitario UANL. In addition two skin biopsies were taken at 4 mm punch in each patient, corresponding to skin lesions and healthy skin respectively. It was later used UVB -nb equipment phototherapy for each patient, 2 times a week, 48 total sessions. At the end of the protocol control biopsies were taken, one in repigmented tissue and the other in tissue that did not undergo treatment response. Skin biopsies were used to extract mRNA by RNAeasy MINIKIT of QIAGEN, it was quantified and used for expression analysis using RNA-Seq (expression analysis by massive sequencing of RNA) in genes involved in pathways of pigmentation skin, apoptosis, oxidative stress, signal transduction and cell survival, in order to identify changes associated with the state of the patient's skin with treatment prognostic utility. The molecular analysis and expression profiling of skin biopsies were performed in the Unit of Molecular Biology, Genomics and Sequencing (UBMGyS) of the Center for Research and Development in Health Sciences (CIDICS) UANL, MTY, Mexico. Clinical results of treatment response were evaluated by two independent investigators and blinded to the results of the massive sequencing of RNA by TruSeq of skin samples. Finally the statistical analysis of expression levels and their relationship with clinical parameters, biochemical and response to treatment was performed by R Bioconductor, SPSS and BaseSpace of Illumina. Results: It was observed that most patients develop the disease before age 30 years, and that the development of the disease is related to a family history of the disease or others of immune nature. The correlation between the clinical results, biochemical and of expression allowed to identify that: low levels of TSH, and high weight in patients can lead to a poor response to UVB-nb treatment. Furthermore expression analysis allowed to detect significant differences in the expression patterns of DCT, MLANA and TYRP1 genes in skin that presented pigment (normal and repigmented) compared with depigmented counterparts (skin with vitiligo and none repigmented skin after treatment). Also a group of genes with predictive utility for response to treatment related pigmentation (DCT and TYRP1), and the response to oxidative stress (CCBL2 and GPD1) was obtained; on the other hand if you consider the kind of vulgar vitiligo according to their disease progression as a determining factor in the response to treatment, the MC1R gene, it may be useful to differentiate between active and stable response groups. Finally analysis using TruSeq Targeted RNA Illumina application suggests participants genes in skin pigmentation (DCT TYRP1 and MLANA), regulation of oxidative stress (GPD1), apoptosis (CSNK1G3, BAX, BCl3 CFLAR, CASP7 and CASP8 ) and the path of MAP kinases (MAPK1) related to cell proliferation and differentiation, as potential molecular markers useful to predict response to treatment. Funding: This project was funded by the ""Support Program for Scientific and Technological Research"" (PAICYT - UANL) CS879-11 number, and resources of the Department of Dermatology, Hospital Universitario Dr. Jose Eleuterio Gonzalez, UANL, MTY , Nuevo Leon, Mexico. "