Terapia celular para la reparación ósea de la cavidad bucal: modelo experimental de defecto mandibular
- Autores: Cynthia Georgina Trejo Iriarte
- Directores de la Tesis: María Julia Araceli Buján Varela (dir. tes.), Natalio García Honduvilla (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eliseo Carrascal Marino (presid.), Gemma Pascual González (secret.), Francisco J. Manso (voc.), Juan Manuel Bellón Caneiro (voc.), Colette Lacabanne (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
La pérdida ósea y dental es considerada en la actualidad uno de los grandes problemas a los que se enfrenta la Odontología Reparadora, para resolverlo su ha desarrollado el uso de implantes intraóseos. Sin embargo, cuando la calidad y cantidad ósea es insuficiente, no es posible aplicar este tratamiento. Surge entonces, la necesidad de buscar terapias alternativas para mejorar la cantidad y la calidad ósea.
Actualmente, en el campo de la Terapia celular mandibular, no existe una extensa bibliografía sobre este tema que pudiera servirnos como guía de actuación.
Nuestro interés en el proceso de reparación/reconstrucción del hueso mandibular, nos llevó a plantearnos la posibilidad de utilizar células mesenquimales aisladas del tejido adiposo subcutáneo (MSCat) como potencial fuente celular.
El objetivo de la presente tesis ha sido determinar si el tejido adiposo una adecuada fuente de células mesenquimales y si podemos establecer las condiciones óptimas para su aplicación como terapia celular osteorreparadora. Así como saber si la terapia celular empleada, puede mejor la reparación ósea mandibular.
En el primer objetivo se diseñó el protocolo para la obtención de células mesenquimales a partir del tejido adiposo subcutáneo (MSCats) de ratas Wistar, así como su caracterización fenotípica a corto y largo plazo, mediante técnicas de microscopía óptica y electrónica de transmisión y barrido, inmunohistoquímicas y de PCR.
Los resultados obtenidos han demostrado que a partir del segundo subcultivo la población celular se encontraba compuesta por células viables hasta muy largos plazos, con una alta capacidad de proliferación (ratio de 206 en 15 días y 5 veces mayor que fibroblastos subcutáneos de rata), y con ritmo modular proliferativo alcanzando un 80% confluencia cada 72 horas durante más de 200 subcultivos. La identificación fenotípica característica de la estirpe mesenquimal fue valorada mediante la positividad en más de un 90% para CD90, C-kit, Vimentina, y se mostraron negativas para CD11b, CD34, CD31 y CD44. Dicha población fue positiva en un porcentaje superior al 60% para marcadores embrionarios de indiferenciación OCT3/4, SOX2 y Nanog durante más de 175 subcultivos.
Las MSCat fueron capaces de diferenciarse a distintas líneas celulares mostrando marcadores fenotípicos característicos de cada diferenciación: ósea (Osteocalcina), adiposa (Oil Red), condrogénica (Safranina) y endotelial (CD31).
La diferenciación inducida hacia la línea osteogénica fue evaluada a diferentes tiempos de estudio: 48 y 72 horas; 7, 14 ,21 y 30 días. Los mejores resultados fueron obtenidos a los 21 días de cultivo en medio osteogénico, donde la población celular mostró un equilibrio en la máxima expresión de características morfológicas y fenotípicas de los marcadores de diferenciación Runx2, Osterix, Osteopontina (OP), Osteocalcina (OCN) y Proteínas morfogenéticas de hueso 2/4 (BMP2/4). Siendo estas condiciones, las elegidas como óptimas para su uso terapéutico (a este grupo células le hemos denominado MSCost).
El segundo objetivo ha sido la aplicación de las líneas celulares MSCat y MSCost como terapia celular autóloga en un modelo de reparación mandibular en rata Wistar. Se realizaron defectos óseos cavitarios en el cuerpo de la mandíbula. Se establecieron 3 grupos de estudio: Grupo MSCat, el defecto cavitario fue tratado con 10x106 MSCat autólogas previamente cultivadas en AmnioMAX, durante 21 días.
Grupo MSCost, cuando el defecto cavitario fue tratado con 10x106 MSCost autólogas.
Grupo control, se realizó un defecto cavitario en el lado izquierdo a todos los especimenes, el cual no fue tratado.
La población celular implantada en el defecto óseo fue marcada con el fluoró cromo PKH26 para su seguimiento dentro del defecto.
De los tres grupos evaluados, en el grupo MSCots la presencia de matriz osteoide en el lugar del defecto fue constatada a los 14 días, para el grupo MSCat a los 30 días y se observó ausente en el grupo control. La neoformación ósea que rellenaba el defecto cavitario a los 30 días del transplante celular en el grupo MSCost alcanzó porcentajes superiores al 70%, versus el 30% observado en el grupo MSCat. En el grupo control solo se pudo observar una pequeña remodelación en los bordes del defecto.
En el análisis de los marcadores osteógenicos pudimos observar que: porcentaje de expresión de Runx2 mostró un incremento estadísticamente significativo (P<0.01) en el grupo MSCost respecto a los grupos MSCat y control, esto fue observado en todos los tiempos de estudio. El patron de expresión de OCN mostró diferencias significativas (p<0.05) entre los grupos MSCost, MSCat y control en los días 7, 14 y 21, siendo el grupo MSCost el que presentó una mayor expresión. Se observó un aumento de expresión en el grupo MSCat a los 21 días para OCN, que resultó significativo (p>0.05) con repecto al grupo control.
Destaca la ausencia de células de estirpe monocitario (Macrófago/Osteoclasto) valoradas mediante ED1 y TRAP.
Los resultados obtenidos nos permiten formular las siguientes conclusiones:
La población aislada a partir de tejido adiposo subcutáneo de rata en las condiciones específicas utilizadas en nuestro modelo (medio de cultivo AmnioMAX) posee las propiedades inherentes a las células mesenquimales y permiten que dichas características puedan ser conservadas y mantenidas en el tiempo.
Esta población MSCat es susceptible de ser diferenciada a la línea osteogénica; se definió un protocolo óptimo para obtención de las MSCost (Inducción de la diferenciación en células en segundo subcultivo utilizando el medio con suplemento osteogénico durante 21 días).
Los resultados obtenidos tras llevar a cabo nuestro modelo in vivo demostraron que en los defectos óseos sometidos a terapia celular MSCost se observó una neoformación ósea más rápida y superior con respecto a los otros grupos de estudio. La máxima eficacia se obtiene tras una diferenciación hacia la línea osteogénica in vitro durante 3 semanas previas al implante in vivo.
Las conclusiones anteriores, nos permiten elevar nuestras hipótesis a categoría de tesis y afirmar que: El tejido adiposo es una fuente accesible de celulas mesenquimales para fines terapeuticos. Las MSCat aisladas por nosotros, cumplen los requisitos exigidos para su uso como terapia celular, así como su capacidad de diferenciación a MSCost, cuya eficacia ha sido probada, mostrando una aceleración en el proceso de remodelación y consolidación ósea del defecto cavitario en la mandíbula de rata.
CELL THERAPY FOR BONE REPAIR OF THE ORAL CAVITY: an experimental model of mandibular defect.
The main problems faced by Odontology in daily practice are bone and tooth loss, actually has now developed intraosseous implants are use. However, these implants can only be used when there is a sufficient amount and quality of preexisting bone such that there is a need for other therapeutic strategies that will improve bone quantity and quality.
In the field of cell therapy of the jaw, existing literature is too scarce to serve as a research guide.
Our interest in the jaw repair/reconstruction process prompted our idea of using adult mesenchymal stem cells derived from subcutaneous adipose tissue (MSCat) as a potential cell source.
The fist objective in this thesis was to establish if the adipose tissue is a good source of mesenchymal stem cells and is it possible to establish the optimal conditions for their use in cell therapy procedures in bone tissue repair. Something Does cell therapy improve the bone repair process in the jaw.
For the first objective, we designed a protocol to harvest MSCat from the subcutaneous tissue of Wistar rats, which have been grown in AmnioMAX medium. The cells were characterized in short- and long-term using light microscopy and scanning and transmission electron microscopy, immunohistochemical, PCR techniques and flow cytometry proliferation assay.
Obtained results showed that after the 2nd passage cell population was composed by viable cells to long periods with highly proliferative (206 ratio in 15 days and five times higher than subcutaneous rat fibroblasts), and modular proliferative rate, reaching 80% confluency every 72 hours for more than 200 passages.
The characteristic phenotype identity of mesenchymal cell population was assessed by positive expression higher than 90% for CD90, C-kit., Vimentin and negativity for CD11b, CD34, CD31 and CD44. The named population was positive in more than 60% for undifferentiated embryonic markers OCT3/4, SOX2 and Nanog for more than 175 subcultures.
MSCat were able to differentiate to the same cells lineages showing characteristic phenotypic markers of each line: osteogenic (Osteocalcin), adipogenic (Oil Red), chondrogenic (Safranin) and endothelial (CD31).
The differentiation to osteogenic lineage was assessed in several study times: 48 and 72 hours; 7, 14, 21 and 30 days. The best results were obtained at 21 days in osteogenic culture medium, where the cell population showed an optimal balance of osteogenic characteristics and phenotype markers Runx2, Osterix, Osteopontin (OP), Osteocalcin (OCN) and Bone morphogenetic proteins 2/4 (BMP 2/4) . Therefore, these conditions were chosen for their therapeutic use, being these cells denominated MSCost.
After second passage, the cell population was mainly comprised of mesenchymal cells with a high capacity of proliferation, adhesion, migration and differentiation under conditioned stimuli.
The second objective was to apply the cell lines MSCat and MSCost as autologous cell therapy in the Wistar rat model of jaw repair. Cavitary bone defects in the mandible body.
MSCat group: created defect was filled with 106 autologous MSCat cultured for 21 days in AmnioMAXmedium.
MSCost group: created defect was filled with 106 autologous MSCost cultured for 21 days in AmnioMAX medium with osteogénic cocktail.
Control group: in all animals, a jaw defect was created on the left side that was not filled.
The cells implanted in the bone defects were labelled with PKH26 fluorochrome so that they could be followed at the defect site. This is how we first demonstrated objectively in this area, that new bone formation was guided by transplanted cells.
From the three groups evaluated, in MSCost group at 14 days the presence of osteoid matriz in the defect site was checked, this was observed at 21 days in MSCat group and in control group could not be observed.
Observed bone neoformation filling the defect at 30 days was over 70% in MSCost, group, versus 30% in MSCat group. In control group only a small remodeling was observed at the edges of the bone defect area.
In the immunohistochemical analysis we found that: Runx2 marker suffered an statistically significant increase (p<0.01) in MSCost group, versus MSCat and control groups observed at all times of study. The OCN pattern of expression showed statistically significant differences (p<0.05) between groups MSCost, MSCat and Control at 7, 14, and 21 days, being MSCost the group that presented the greatest expression. It was also observed a significant increase (p<0.05) in the expression OCN marker in MSCost group of 21 days versus control group.
Resulted interesting the absence of monocyte/macrophage lineage cells in the defect area, a fact that was assessed by ED-1 and TRAP staining.
Based on these findings, the following conclusions may be established: The cell population isolated from subcutaneous adipose tissue of rat, in the specifics conditions used in our model (AmnioMAX media culture), shows inherent properties of mesenchymal cells. Used conditions allow both preservation and maintainace of these characteristics over time.
MSCat population is susceptible to differentiation to osteogenic lineage; we have defined an optimal protocol for obtaining MSCost (Osteogenic induction in the second subculture using media with osteogenic cocktail for 21 days).
The results obtained after carrying out our in vivo model showed that in the bone defects undergoing MSCost cell therapy was observed a faster healing, higher new bone formation and superior quality of mineralization compared with the other study groups.
The best efficiency was obtained with 3 weeks of in vitro osteogenic differentiation in vitro 3 weeks previous to in vivo transplant.
According to these conclusions, our starting hypotheses can be elevated to the category of thesis and we can state that:
The adipose tissue is an accessible source of mesenchymal cells for therapeutic use. The MSCat isolated by us satisfy all the requisites for their use as cell therapy, and its ability to differentiate to MSCost, whose effectiveness has been tested, showing acceleration in the remodelling and bone healing process, in the cavitary defect in the rat mandible.
