Resumen de Freqüència i patró de l'heteroplàsmia mitocondrial humana
Amanda Ramos Reche
La investigació desenvolupada en la present Tesi està enfocada a l’estudi de l’heteroplàsmia mitocondrial humana. Els treballs d’heteroplàsmia mitocondrial que s’han publicat fins al moment d’inici de la Tesi s’han centrat en la regió no codificant del DNA mitocondrial (DNAmt) i no hi ha cap estudi on s’utilitzin seqüències completes de DNAmt. Per detectar correctament l’heteroplàsmia mitocondrial, cal tenir en compte la presència dels anomenats NUMTs (insercions nuclears d’origen mitocondrial). A causa de l'elevada similitud entre NUMTs i DNAmt, una co-amplificació entre ells podria comprometre la veracitat dels resultats. Actualment, no existeix en la bibliografia cap treball on s’utilitzin primers que evitin la co-amplificació amb NUMTs. D’altra banda, les bases de dades de NUMTs descrites fins el moment presenten una gran discrepància en el nombre total de NUMTs i han estat realitzades amb una versió antiga de l’esborrany del genoma humà. Els objectius de la Tesi són els següents: 1) establir una metodologia adequada per a la correcta amplificació i seqüenciació del genoma mitocondrial humà que eviti la co-amplificació amb NUMTs; 2) realitzar una exhaustiva compilació de les insercions nuclears d'origen mitocondrial basada en la darrera versió de l’esborrany del genoma humà (GRCh37); 3) avaluar l’impacte de la contaminació per NUMTs en estudis de càncer com un exemple d’aplicació de la base de dades descrita; 4) determinar la freqüència i el patró de l’heteroplàsmia en la totalitat del genoma mitocondrial; i 5) comparar el patró mutacional de l’heteroplàsmia mitocondrial amb l’observat a nivell poblacional. La metodologia així com la presentació dels resultats i la discussió s’han organitzat en 3 capítols dirigits a respondre els diversos objectius. En el primer capítol s’ha dut a terme el disseny i la validació d’un conjunt de primers que permet l’amplificació i seqüenciació completa de genoma mitocondrial. A més, aquests primers estan dissenyats de manera que eviten la co-amplificació amb DNA nuclear (DNAn). Finalment, i com a conseqüència de l’actualització de l’esborrany del genoma humà, s’han re-avaluat aquests primers, havent-se de redissenyar una de les parelles. En el segon capítol es presenta la compilació de les 755 insercions nuclears d’origen mitocondrial realitzada tenint en compte el darrer esborrany del genoma humà GRCh37. En aquesta base de dades, es presenten per primera vegada les posicions no idèntiques entre el DNAmt i el DNAn. Aquestes posicions han estat la base per l’aplicació de l’exemple que s’ha realitzat en estudis de càncer, avaluant així l’impacte de la contaminació per NUMTs. En el tercer i darrer capítol es presenta l’estudi exhaustiu sobre la freqüència i patró de l’heteroplàsmia mitocondrial humana mitjançant la seqüenciació completa del genoma mitocondrial de 101 individus. Alhora aquesta informació s’ha utilitzat per realitzar una comparativa amb l’espectre mutacional a nivell poblacional. Aquest és el primer treball on es descriuen per primera vegada un conjunt d’eines essencials pel correcte estudi de l’heteroplàsmia mitocondrial humana: es presenta un conjunt de primers que permeten amplificar i seqüenciar selectivament la totalitat del genoma mitocondrial i s’ha generat una base de dades d’insercions nuclears d’origen mitocondrial basada en el nou esborrany del genoma humà GRCh37, reportant alhora les posicions no-idèntiques entre el DNAmt i els NUMTs. És la primera vegada on s’analitza la freqüència i el patró de l’heteroplàsmia mitocondrial humana en individus sans. El 62.37% de la població presenta heteroplàsmia mitocondrial (de longitud i/o puntual) i un 24.75% d’individus presenta heteroplàsmia puntual, posant de manifest l’elevada freqüència d’heteroplàsmia mitocondrial a nivell poblacional. La distribució de l’heteroplàsmia mitocondrial comprèn tot el genoma mitocondrial, localitzant-se tant en posicions definides com a hotspot com en posicions altament estables i conservades. Comparant el patró mutacional de l’heteroplàsmia amb el descrit a nivell poblacional, sembla haver-hi un excés d’heteroplàsmia puntual localitzada en posicions que presenten zero hits en la filogènia. L’excés de transicions detectat en l’espectre mutacional de l’heteroplàsmia, en comparació amb el descrit a nivell poblacional, implica que determinades forces evolutives com la deriva o la selecció han hagut d’actuar perquè finalment siguin eliminades. En aquest context, les heteroplàsmies puntuals localitzades en posicions estables podrien tenir un gran impacte en la supervivència de la pròpia mitocòndria, suggerint que la selecció purificadora hauria d’estar actuant per prevenir la seva fixació en els individus. Aquest és el primer treball on s’analitza la freqüència i el patró de l’heteroplàsmia mitocondrial humana en individus sans. Tenint en compte l'elevada quantitat de dades que es presenta unit a la poca informació prèvia disponible, aquest treball proporciona una nova perspectiva per a l'estudi de les malalties associades al DNAmt així com en treballs a nivell poblacional, evolutiu i forense.
