New insights into the toxicity of nanomaterials by means of the use of fish and mammalian cell lines
- Autores: Tobias Lammel
- Directores de la Tesis: José María Navas Antón (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2014
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Luisa Fernández-Cruz (presid.), Paloma Fernández Freire (secret.), Willie J. Peijnenburg (voc.), Azucena Bermejo Nogales (voc.), Yolanda Pérez Cortés (voc.)
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- Resumen
Summary Nanotechnology is being expected to revolutionize many areas of society. Its innovative capacity consists in the technological exploitation of the unique physico-chemical properties many materials show as their size reaches the nanometer range. While such materials referred to as ¿engineered nanomaterials (ENMs)¿ hold great potential to enhance the performance of a wide range of industrial and consumer applications and thus promise to bring great benefit to society, their potentially different behaviour in and effect on biological systems in comparison to their macroscopic counterparts give rise to concern about their safety for human and environmental health.
The objective of this doctoral thesis was to evaluate the cytotoxic potential and modes of action of different ENMs, namely zinc oxide (ZnO) nanoparticles (NPs) and oxygen-functionalized graphene nanomaterials (GNMs), using the human and fish hepatoma cell lines Hep G2 and PLHC-1 as in vitro experimental model. In this regard, special consideration was given to the assessment of the relationship between particular physico-chemical properties of the studied nanomaterials (NMs) such as size and surface chemistry and their biological activity. Apart from this, it was aimed to investigate the role of certain aspects that may be of particular relevance to the toxicity of the studied NMs. Thus it was aimed to assess if the cytotoxicity exhibited by ZnO NPs involves the action of extracellularly released Zn ions, and if oxygen-functionalized GNMs are able to influence the in vitro toxicokinetics of aromatic environmental pollutants. Moreover, it was aimed to assess the applicability of classical (and new) cytotoxicity assays for evaluating ZnO NP and GNM toxicity as well as the differences in the response of the human and fish cell culture models.
The cytotoxicity assessment of ZnO NPs was carried out using three commercial ZnO nanopowders (denominated nZnO-1, nZnO-2 and nZnO-3) that differed in their size (< 100 nm, < 50 nm and 20 ¿ 30 nm) and a commercial ZnO fine powder (< 5 µm) as bulk control. The cytotoxic potential of oxygen-functionalized GNMs was evaluated using commercially available graphene oxide (GO) and carboxyl graphene (CXYG) nanoplatelets. Both ZnO NPs and GO/CXYG nanoplatelets were thoroughly characterized using a variety of analytical techniques. Transmission electron microscopy (TEM) was used to obtain data about the morphology of the ZnO NPs prior and after incubation in cell culture media, and also provided information about their primary particle size-frequency distribution. TEM was also employed to characterize GO/CXYG nanoplatelets with regard to their general morphology. The height, lateral dimension and shape of the nanoplatelets were determined using atomic force microscopy (AFM). The size frequency distribution of ZnO NP and GO/CXYG suspensions in water and cell culture media was characterized by means of dynamic light scattering (DLS). Inductively coupled plasma mass spectroscopy (ICP-MS) was used to measure the dissolution/solubility of the ZnO NPs in different cell culture media as well as their concentrations in the suspensions and the culture vessel during exposure.
The cytotoxicity of ZnO NP and GO/CXYG nanoplatelets to Hep G2 and PLHC-1 cell cultures was assessed by means of a battery of assays covering different modes of toxic action. Plasma membrane damage was determined measuring lactate dehydrogenase (LDH) leakage into the medium or measuring cytosolic esterase activity using 5-carboxyfluorescein diacetate acetoxymethyl ester (CFDA-AM). Impairment of metabolic activity was measured using alamarBlue and dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium salt (MTT). Alterations in structural or functional lysosomal integrity were measured using the Neutral Red Uptake (NRU) assay. Changes in the structural and functional integrity of mitochondria were evaluated using the Mitochondrial Membrane Potential (MMP) assay. In addition, a new cytotoxicity assay (LUCS) measuring alterations in DNA double helix structure was assessed for its applicability in the fish cell line. The potential of the NMs to induce oxidative stress was assessed by measuring intracellular reactive oxygen species (ROS) levels. Potential interferences of the NMs with the assays were accounted for by including adequate controls. GO/CXYG were additionally assessed with regard to their ability to directly or indirectly interfere with the assay reagents through (auto-)fluorescence, quenching and reduction-oxidation (redox) reactions. In parallel to the cytotoxicity assessment using fluorescence-based assays, the interaction, cellular uptake and intracellular fate of GO/CXYG nanoplatelets was studied using scanning electron microscopy (SEM) and TEM.
The ability of GO/CXYG to alter the toxicokinetics of aromatic environmental pollutants in vitro was studied through simultaneous and sequential exposure of PLHC-1 cell cultures to GO/CXYG nanoplatelets and aromatic chemicals (ß-naphthoflavone (ß-NF), benzo(k)fluoranthene (BkF) and 3,3',4,4',5,5'-Hexachlorobiphenyl (PCB169)) that are ligands of the aryl hydrocarbon receptor (AhR), a nuclear receptor whose activation induces the expression of xenobiotic-metabolising enzymes such as cytochrome P450 1A (Cyp1A). After the exposure, Cyp1A-dependent ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity and cyp1A mRNA expression levels were measured.
DLS analysis of the ZnO NPs used in this study revealed that in serum-free culture medium all ZnO NPs formed large agglomerates/aggregates with hydrodynamic diameters in the micrometer range. ZnO NP agglomeration/aggregation followed by sedimentation led to deviations of the real exposure concentrations from the nominal concentrations. The dissolution of ZnO NPs in serum-free culture medium resulted in the release of Zn ions and changes in their primary morphology. The solubility of ZnO NPs was generally higher in PLHC-1 cell culture medium (¿-MEM) than in Hep G2 cell culture medium (EMEM). Exposure to ZnO NP suspensions caused a dose-dependent decrease in PLHC-1 and Hep G2 cell viability. The degree of cytotoxicity was independent on the primary and secondary size of the different ZnO NPs if the data were analysed on the basis of the measured exposure concentrations. The assays used for the cytotoxicity assessment of ZnO NPs showed the same order of relative sensitivity in both cell lines, with the LDH assay being the most sensitive followed by the MTT and the NRU assay. The LUCS assay showed higher sensitivity for the ZnO nanopowders but lower sensitivity for the ZnO fine powder compared to the traditional cytotoxicity assays. Treatment of the cell cultures with the supernatants of centrifuged ZnO NP suspensions demonstrated that ZnO NP cytotoxicity in Hep G2 cell cultures was mainly attributed to the dissolved Zn fraction including Zn ions and colloidally suspended solid Zn species. In PLHC-1 cells, the contribution of the dissolved Zn fraction to the cytotoxic effect caused by the ZnO NP suspensions was lower than in Hep G2 cells. In general, PLHC-1 cell cultures were found to be less susceptible to ZnO NP suspension-induced cytotoxicity than Hep G2 cell cultures. Cell line-dependent differences were also observed with regard to the intracellular ROS levels induced by the ZnO NPs. While in PLHC-1 cells intracellular ROS levels were found to be significantly elevated at the highest exposure concentrations, in Hep G2 cells no increase in intracellular ROS levels could be observed. This suggested that ZnO NP cytotoxicity was not caused through oxidative stress.
GO and CXYG showed different colloidal stability in dependence on the medium composition. In serum-free culture media GO and CXYG nanoplatelets underwent rapid flocculation leading to sedimentation of a large fraction of the NM. GO and CXYG suspensions prepared in serum-supplemented culture medium however showed high stability as evidenced by DLS analyses conducted at regular time intervals (24, 48 and 72 h). Both graphene derivatives had a high affinity for the plasma membrane and were observed to cause structural damage of the latter at concentrations as low as 0.125 and 4 µg/ml in PLHC-1 and Hep G2 cells, respectively, after 72 h of exposure. GO and CXYG nanoplatelets were further observed to pierce through the plasma membrane and accumulate in the cytosol of PLHC-1 and Hep G2 cells. The observation that GO/CXYG platelets of different lateral dimensions were able to enter the cytosol and some of them were not enveloped by membrane suggested that uptake occurred through a spontaneous, endocytosis-independent mechanism. The GO and CXYG platelets were found to physically interact with mitochondria causing mechanical injury to their membranes. GO and CXYG-induced impairment of mitochondrial function was also indicated by a dose-dependent decrease in fluorescence intensity in the MMP assay. The interaction with other cellular organelles including lysosomes and the nucleus was also observed, but less frequent. Exposure to GO and CXYG led to alterations in the cellular ultrastructure and metabolic activity. In addition, an increase in intracellular ROS levels was observed which was possibly related with GO/CXYG-induced mitochondrial damage.
As in the ZnO NP treatment, intracellular ROS levels were observed to be higher in PLHC-1 than in Hep G2 cells. However, no differences in the cytotoxicity were observed between the two cell lines after GO/CXYG-treatments. Furthermore, no differences in the qualitative or quantitative expression of toxic effects were observed between GO and CXYG suggesting that cytotoxicity, uptake and intracellular fate of the GNMs was independent of the type and abundance of oxygen-functional surface groups. Despite the abundant intracellular accumulation of GO and CXYG, neither PLHC-1 nor Hep G2 cell cultures were significantly affected with respect to cell growth and proliferation as evidenced by similar total protein contents in treatments and controls. Taken into account all the acquired information it can be suggested that oxygen-functionalized GNMs exhibit lower cytotoxicity than ZnO NPs.
In the experiments addressing potential combination effects between GNMs and aromatic environmental pollutants it was observed that PLHC-1 cell cultures pre- and co-exposed to fixed concentrations of either GO or CXYG and increasing concentrations of either ß-NF, BkF or PCB169 demonstrated higher EROD activity and cyp1A mRNA expression levels than cells exposed to the chemicals alone. The degree of the potentiating effect of GO and CXYG on the chemical-induced response was dependent on the concentration but independent on the differences in the physico-chemical properties of GO and CXYG. Furthermore, the potentiating effect was observed to be more pronounced for the AhR agonists with higher logP (BkF and PCB169). The results suggest an enhanced diffusion of the chemical through the physically damaged plasma membrane and/or their enhanced cellular uptake though GO/CXYG-mediated ¿transport¿ across the plasma membrane followed by intracellular re-dissociation.
The above stated results demonstrate that cell culture-based in vitro assays can be a useful tool on the way to understanding NM toxicity. The application of various cytotoxicity assays covering different modes of toxic action can give a robust picture of the overall cytotoxic potential of a given NM as well as first indications about the possible modes of action involved. Thus they can be used to rank or categorize ENMs with respect to their degree or type of toxicity or to obtain information about the relationship between the qualitative and quantitative expression of cytotoxic effects and specific NM properties. This work also shows that a thorough characterization of the physico-chemical properties and measurements of the real exposure concentrations can be essential to draw correct conclusions from cytotoxicity data. In addition, it is evidenced that the type of cell culture medium used for cytotoxicity studies can have a significant influence on the dissolution and dispersibility of NMs and thus the form and concentration in which they are present in the assay. Besides, the effect(s) caused by a given NM may qualitatively and quantitatively differ in dependence on the cell culture model used for its assessment. Moreover, the results obtained in this doctoral thesis also suggest that NMs cannot be readily considered as safe if they exhibit low cytotoxicity as they might pose a hazard through combination effects with traditional contaminants. All these factors have to be taken into consideration when evaluating the toxicity of ENMs.
Resumen La nanotecnología tiene un gran potencial para revolucionar muchas áreas de la sociedad. Su capacidad innovadora consiste en la explotación tecnológica de las excepcionales propiedades físico-químicas que muchos materiales evidencian cuando su tamaño alcanza el rango nanométrico. Estos materiales, conocidos como ¿nanomateriales manufacturados¿ (NMs), muestran unos prometedores beneficios para la sociedad debido a su gran potencial para mejorar el rendimiento de una amplia variedad de productos tanto industriales como de consumo. Sin embargo, las posibles variaciones de su comportamiento en sistemas biológicos y los posibles efectos sobre ellos hacen surgir preocupaciones sobre su seguridad para la salud humana y el medio ambiente.
El objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar el potencial citotóxico y los mecanismos subyacentes a la acción tóxica de diferentes NMs, especificamente nanoparticulas (NPs) de óxido de zinc (ZnO) y nanomateriales de grafeno (GNMs) funcionalizados con grupos oxígeno, usando líneas celulares derivadas de un hepatoma humano (Hep G2) y de pez (PLHC-1) como modelos experimentales in vitro. Se tuvo en cuenta especialmente la relación entre las propiedades físico-químicas particulares de los NMs, tales como el tamaño o la química de superficie, y la actividad biológica. También se intentó averiguar cuál era el papel de otras propiedades que podrían tener una particular relevancia para la toxicidad de los NMs estudiados. En este sentido, se trató de estudiar, por un lado, si la citotoxicidad provocada por las NPs de ZnO está relacionada con la acción de iones de Zn liberados de su superficie al espacio extracelular y si, por el otro lado, los GNMs pueden alterar la toxicocinética in vitro de contaminantes ambientales aromáticos. En paralelo, este trabajo pretendió evaluar además tanto la aplicabilidad de ensayos de citotoxicidad clásicos y nuevos para estudiar la toxicidad de los NMs, como las diferencias en la respuesta de las líneas celulares humana y de pez.
Para la evaluación de la citotoxicidad de las NPs de ZnO se han usado tres formas nanoparticuladas de ZnO disponibles comercialmente (denominadas nZnO-1, nZnO-2 and nZnO-3) de diferente tamaño (< 100 nm, < 50 nm and 20 ¿ 30 nm, respectivamente). Una micropartícula comercial de ZnO (< 5 µm) sirvió como referencia. El potencial citotóxico de los GNMs se ha evaluado usando nanocopos de óxido de grafeno (GO) y de grafeno carboxilado (CXYG) disponibles comercialmente. Las NPs de ZnO y los nanocopos de GO/CXYG se han caracterizado minuciosamente usando diversas técnicas analíticas. La microscopia electrónica de transmisión (TEM) sirvió para obtener información sobre la morfología de las NPs prístinas de ZnO y tras suspenderlas en medio de cultivo celular y sobre la distribución de la frecuencia de tamaño. La TEM también se empleó para caracterizar la morfología general de los nanocopos de GO/CXYG. Su espesor, dimensión lateral y forma se estableció usando microscopía de fuerza atómica (AFM). Además, métodos basados en la dispersión dinámica de la luz (DLS) sirvieron para caracterizar, adicionalmente, la distribución de la frecuencia de tamaño de las NPs de ZnO y de GO/CXYG en agua y medio de cultivo. La espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) permitió medir las concentraciones de Zn en las suspensiones durante la fase de exposición de las células a las NPs de ZnO y obtener una idea del grado de disolución de las NPs.
Para evaluar la citotoxicidad se utilizó una batería de ensayos que cubren diferentes modos de acción tóxica. Los posibles daños en la membrana plasmática se evidenciaron midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) desde la célula al medio de cultivo o la actividad de esterasas citosólicas mediante el éster acetoximetil de 5-diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-AM). Las modificaciones del metabolismo celular se midieron empleando alamarBlue o bromuro de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT). La alteración de la integridad estructural o funcional de los lisosomas se midió utilizando rojo neutro (NR). Los cambios en la integridad estructural o funcional de las mitocondrias se observaron a través del potencial de la membrana mitocondrial (MMP). Además, se evaluó la aplicabilidad a una línea celular de pez de un nuevo ensayo de citotoxicidad (LUCS), basado en la detección de alteraciones en la doble hebra de ADN. El potencial de los NMs de inducir estrés oxidativo ha sido evaluado midiendo el nivel intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS). En todo momento se tuvo en cuenta la interferencia potencial de los NMs con los ensayos y se incluyeron los controles adecuados. También se contempló la posibilidad de que los nanocopos de grafeno interfirieran, de manera directa o indirecta, con los reactivos del ensayo a través de (auto-) fluorescencia, desactivación fluorescente (¿quenching¿) y reacciones de oxidación-reducción (redox). Además de todo esto se estudió la interacción, la internalización y el destino intracelular de los nanocopos de GO y CXYG por medio de microscopia electrónica de barrido (SEM) y TEM.
La habilidad del GO y del CXYG de alterar la toxicocinética in vitro de contaminantes ambientales aromáticos se estudió exponiendo cultivos de células PLHC-1, simultáneamente o secuencialmente a GO/CXYG y a compuestos aromáticos (ß-naftoflavona (ß-NF), benzo(k)fluoranteno (BkF) y 3,3¿,4,4¿,5,5¿-Hexaclorobifenilo (PCB169)). Estas sustancias son ligandos del receptor de hidrocarburos aromáticos (AhR), receptor nuclear cuya activación induce la expresión de proteínas, como el citocromo P450 1A (Cyp1A), involucradas en el metabolismo de xenobióticos. Tras las exposiciones a los GNMs y los compuestos aromáticos se midieron los niveles de ARNm correspondientes al gen cyp1A y los de la actividad etoxirresorrufina-O-deetilasa (EROD), directamente dependiente del Cyp1A.
El análisis de las NPs de ZnO por medio de DLS reveló que forman grandes aglomerados o agregados con diámetros hidrodinámicos en el rango micrométrico. La sedimentación que sigue a la aglomerarción o agregación de las NPs causó importantes desviaciones entre las concentraciones reales de exposición y las nominales. La disolución de las NPs de ZnO en medio de cultivo sin suero supuso la liberación de iones de Zn y dio lugar a cambios morfológicos de las NPs. En general, la solubilidad de las NPs de ZnO fue más alta en ¿-MEM (medio de cultivo de las células PLHC-1) que en EMEM (medio de cultivo de las células Hep G2). Tras la exposición de las células a las suspensiones de las NPs de ZnO se observó una reducción en la viabilidad de las dos líneas celulares utilizadas. Tal reducción fue independiente del tamaño de las NPs cuando se refirió a concentraciones reales de exposición. Con respecto a la sensibilidad de los ensayos de citotoxicidad utilizados se observó que el ensayo LDH fue el más sensible, seguido por los ensayos MTT y NR. Por su parte, el ensayo LUCS mostró una sensibilidad mayor que los anteriores para las NPs de ZnO, pero menor para la micropartícula. El tratamiento de los cultivos celulares con los sobrenadantes de suspensiones de NPs de ZnO centrifugadas demostró que la citotoxicidad es principalmente causada por la fracción disuelta de Zn que incluye iones de Zn y especies sólidas de Zn en suspensión coloidal. No obstante, en las células PLHC-1, la fracción disuelta de Zn contribuyó al efecto citotóxico en menor medida que en las células Hep G2. En general, las NPs de ZnO tuvieron un menor efecto citotóxico en las células PLHC-1 que en las células Hep G2. También se observaron diferencias entre las dos líneas celulares con respecto a los niveles de ROS. En las células PLHC-1 hubo un aumento de los niveles de ROS que se relacionó directamente con las concentraciones de NPs de ZnO a las que estuvieron expuestas mientras que en las células Hep G2 no se pudo observar ningún incremento en los niveles de ROS. Esto sugiere que en el presente estudio las NPs de ZnO no causaron citotoxicidad por estrés oxidativo.
Por su parte, los derivados de grafeno utilizados en este trabajo mostraron diferente estabilidad coloidal en función de la composición del medio de cultivo. Así, cuando el medio de cultivo no iba acompañado de suero experimentaron una floculación rápida lo que supuso la sedimentación de una gran parte del NM. Sin embargo, las suspensiones de GO y CXYG preparadas en medio de cultivo con suero presentaron una alta estabilidad, tal y como se comprobó por medio de análisis de DLS efectuados a intervalos de tiempo regulares (24, 48 and 72 h). Ambos derivados de grafeno mostraron una alta afinidad por la membrana plasmática y causaron daño estructural en la misma a concentraciones tan bajas como 0.125 y 4 µg/ml en las celulas PLHC-1 y Hep G2, respectivamente, tras 72 h de exposición. Se observó que los nanocopos de GO y CXYG son capaces de penetrar a través de la membrana plasmática y acumularse en el citosol de las células sin que se observe, en varios casos, una membrana que los envuelva. Todo ello sugiere que su internalización se produce a través de un mecanismo espontáneo diferente a la endocitosis.
También es de resaltar que el GO y el CXYG interactúan físicamente con la membrana mitocondrial dañándola. El resultado es una disfunción mitocondrial asociada a una reducción en la intensidad de fluorescencia en el ensayo MMP. También, aunque con menor frecuencia, se observó una interacción con otros orgánulos celulares incluyendo lisosomas y núcleo. Además, se advirtió un incremento en los niveles de ROS que posiblemente estuvo relacionado con el daño de las mitocondrias. Al igual que en el tratamiento con NPs de ZnO, los niveles de ROS fueron más altos en las células PLHC-1 que en las células Hep G2. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre las dos líneas celulares en la citotoxicidad causada por los GNMs. El hecho de que no se constataran diferencias entre la citotoxicidad causada por el GO y el CXYG sugiere que la citotoxicidad, la internalización y el destino intracelular de los copos de grafeno es independiente del tipo y abundancia de los grupos oxígenos de su superficie. A pesar de la abundante acumulación intracelular de GO o CXYG, no hubo variaciones en el contenido en proteína total de los cultivos celulares expuestos a los diferentes tratamientos, lo que sugiere que no hubo alteraciones en el crecimiento o proliferación celular. Teniendo en cuenta toda la información acumulada se puede sugerir que los GNMs causan menos citotoxicidad que las NPs de ZnO.
En los experimentos llevados a cabo para investigar los potenciales efectos de la combinación entre GNMs y contaminantes ambientales aromáticos, se observó que en los cultivos de células PLHC-1, pre o coexpuestas a concentraciones fijas de GO/CXYG y a concentracions crecientes de ß-NF, BkF o PCB169, los niveles de actividad EROD y ARNm de cyp1A fueron más altos que en las células expuestas únicamente a las sustancias químicas. El grado del efecto potenciador del GO y del CXYG sobre la respuesta inducida por los compuestos aromáticos fue solamente dependiente de la concentración de GO o de CXYG. Ese efecto potenciador fue más pronunciado para los compuestos con el logP más alto (BkF y PCB169). Estos resultados sugieren que este efecto fue debido a un aumento de la difusión de las sustancias químicas a través de la membrana plasmática físicamente dañada y/o a su transporte al interior de las células mediado por los GO/CXYG. Los resultados expuestos anteriormente demuestran que los ensayos in vitro basados en cultivos celulares pueden servir como herramienta para entender la toxicidad de NMs. La aplicación de varios ensayos de citotoxicidad cubriendo diferentes modos de acción tóxica puede dar una imagen clara del potencial citotóxico general de un NM así como de los posibles modos de acción. Por lo tanto, los ensayos de citotoxicidad in vitro pueden ser utilizados para ordenar o categorizar NMs con respecto a su grado o tipo de citotoxicidad, o para obtener información sobre la relación entre la expresión cualitativa y cuantitativa de los efectos citotóxicos y propiedades específicas de los NMs. Este trabajo también muestra que la caracterización detallada de las propiedades fisico-químicas y las medidas de las concentraciones reales de exposición pueden ser esenciales para evitar conclusiones erróneas. Además, se demuestra que el tipo de medio de cultivo usado para los estudios de citotoxicidad puede influir en la disolución y dispersabilidad de los NMs, así como en la forma y concentración en que están presentes en el ensayo. Asimismo, los efectos causados por un NM pueden ser diferentes, cualitativa o cuantitativamente, en función del modelo celular usado para su evaluación. Es más, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral sugieren que los NMs no pueden ser considerados seguros simplemente por mostrar baja citotoxicidad puesto que pueden dar lugar a un aumento del riesgo de otros contaminantes tradicionales si se producen exposiciones combinadas. Todos estos factores han de tenerse en cuenta al evaluar la toxicidad de los NMs.
