El sistema reductor de nitrato de "Azobacter chroococcum"

• Autores: Miguel García Guerrero
• Directores de la Tesis: Manuel Losada Villasante (dir. tes.), José María Vega Piqueres (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 1973
• Idioma: español
• Número de páginas: 168
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  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • La gran importancia biológica del metabolismos del nitrógeno inorgánico radica en el hecho de que la fuente de nitrógeno para todas las formas de vida existentes, en último término, el nitrógeno inorgánico.

    Nasón (1962) ha expuesto la idea de que la evolución de los sistemas biológicos se ha resuelto según una relación nutricional determinada entre los organismos con respecto a la capacidad de utilización de las diferentes formas de nitrógeno. Así, prácticamente todas las plantas y muchos microorganismos que son capaces de transformar los diferentes compuestos oxidados inorgánicos de nitrógeno en sus formas más reducidas, esto es, amoniaco y grupos amino- representarían la base de una pirámide ecológica típica, dependientes de esta base, se encontrarían todas las demás formas de vida �tales como determinados microorganismos y virtualmente todos los animales, incluyendo el hombre � que cubren sus requerimientos de nitrógeno tomándolo exclusivamente como nitrógeno orgánico o amoniacal, ya que son incapaces de transformar los compuestos más oxidados de nitrógeno inorgánico hasta este nivel.

    El metabolismo del nitrógeno inorgánico en todas sus diversas facetas ha sido objeto de amplias revisiones (Nason y Takahashi, 1958; Naso, 1962; Takahashi et al., 1963). Aquí, sin embargo, sólo consideramos el aspectos de la reducción biológica del nitrógeno nítrico como caso particular del amplio campo del metabolismos del nitrógeno inorgánico, ya que el tema de esta Tesis se centra sobre el punto concreto de la reducción del nitrato con fines asimilatorios en bacterias.

    El nitrato, es por su gran abundancia �excepción hecha del nitrógeno atmosférico, que sólo puede ser utilizado por un número reducido de organismos- la forma oxidada de nitrógeno inorgánico que utilizan las plantas y algas verdes, así como otros microorganismos que poseen la facultad de reducirlo. Existen dos diferentes tipos de reducción de nitrato (Nason, 1962; Takahashi et al., 1963): a) reducción disimilatoria de nitrato o reducción respiratoria de nitrato y b) reducción asimiliatoria de nitrato o asimilación de nitrato. En la reducción respiratoria de nitrato, que tiene lugar en diversos microorganismos bajo condiciones anaeróbicas o semianaeróbicas, el nitrato se utiliza como aceptor terminal de electrones de la cadena respiratoria, sustituyendo al oxígeno en este papel: los distintos productos resultantes de su reducción (nitrito, nitrógeno molecular, amoniaco, oxido nítrico oxido nitroso, etc.) no son utilizados por las células, y normalmente se excretan al medio. En la reducción asimilatoria de nitrato, que tiene lugar en muchos organismos aeróbicos, el nitrato se reduce hasta amoniaco, que es utilizado posteriormente por la biosíntesis de los constituyentes celulares nitrogenados, como son, fundamentalmente, las proteínas y los ácidos nucléicos.

    El proceso de la reducción asimilatoria de nitrato en organismos fotosintéticos se encuentra en estos momentos en una fase muy avanzada de estudio �tanto a nivel celular como a nivel bioquímico- (Losada, 1972), así como, también se conocen bastantes aspectos de este proceso en hongos y levaduras que asimilan nitrato (Nason et al., 1954; Silver, 1957; Nicholas et ak., 1960; Pichinoty y Néténier, 1966; Pateman et al., 1967; Cook y Sorger, 1969; Garrett y Nason, 1969; Downey, 1971; Garrett, 1972; Rivas et al., 1973). En contraste con la asimilación de nitrato en el reino vegetal, poco se sabía hasta la fecha sobre el sistema reductor del nitrato en bacterias asimiladoras de nitrógeno nítrico (Naso, 1962; Takahashi et al., 1963; Hewitt y Nicholas, 1964), lo que explica el interés existente en aclarar el mecanismo del proceso en estos microorganismos. Esto ha motivado el estudio en la bacteria Azotobacter chroococcum �tanto a nivel celular como subcelular y enzimático- del sistema asimilatorio reductor del nitrato; los resultados obtenidos y la interpretación y discusión de los mismos constituyen el trabajo que aquí se presenta.

    La reducción asimilatoria del nitrato a amoniaco en tejidos fotosintéticos ocurre en dos diferentes estadios, ninguno de los cuales requiere ATP ni compuestos de carbono (Losada, 1972). En primer lugar, el nitrato se reduce en nitrito en una reacción que implica la transferencia de dos electrones, catalizada por la nitrato reductasa. A continuación, el nitrito se reduce a amoniaco en una reacción donde se transfieren seis electrones, catalizada por la nitrito reductasa. De manera idéntica tiene lugar la asimilación de nitrato por hongos y levaduras.

    En este trabajo, hemos mostrado que, en la bacteria A. chroococcum la reducción asimilatoria de nitrato a amoniaco transcurre según un mecanismo análogo al anteriormente descrito, lo que supone la existencia de un modelo universal para todos los organismos que utilizan el nitrato con fines asimilatorios.

    La nitrato reductasa de organismos fotosintéticos ha sido caracterizada exhaustivamente en los últimos años, habiendo sido clasificada como NADH-nitrato reductasa (Hewitt y Nicholas, 1964; Beevers y Hageman, 1969; Kessler, 1971; Losada, 1972). A excepción de la especificidad para los piridín nucleótidos, la NADH-nitrato reductasa de células verdes (Relimpio et al., 1971 a; Jetschmann et al., 1972; Moreno et al., 1972) parece ser muy similar a la NADPH-nitrato reductasa de levaduras y hongos asimiladores de nitrato (Silver, 1957, Pichinoty y Méténier, 1966; Garrett y Nason, 1969; Downey, 1971; Rivas et al., 1973). La NAD(P)H-nitrato reductasa de plantas en sentido amplio es un complejo enzimático adaptativo de alto peso molecular con, al menos, dos diferentes actividades, las cuales participan secuencialmente en la transferencia de electrones desde el NAD(P)H al nitrato: la primera es una NAD(P)H diaforasa dependiente de FAD, que puede utilizar diferentes compuestos oxidados (tales como el citocromo c) como aceptores de electrones, y la segunda es la molibdoproteína nitrato reductasa terminal, también denominada FNH2-nitrato reductasa por su capacidad para utilizar flavín nucleótidos (o viológenos) reducidos, concomo donadores de electrones. Ambas actividades se afectan de distinto modo por diferentes tratamientos e inhibidores selectivos; en general, la actividad diaforásica es muy sensible al calentamiento y a la acción de reactivos que se unen a los grupos �SH, mientras que la nitrato reductasa terminal puede ser inhiba por compuestos acomplejantes de metales (Zumft et al., 1970; Relimpio et al., 1971ª; Vega et al., 1972).

    Los datos acerca de la nitrato reductasa en bacterias que reducen nitrato con fines asimilatorios eran bastante exiguos y han sido recogidos por Nason (1962), Takahashi et al., (1963) y Hewitt y Nicholas (1964). Una nitrato reductasa soluble, obtenida de células de Escherichia coli estirpe B, que, presumiblemente, asimilaban nitrato, fue purificada por Nicholas y Nason (1955); el enzima era metaloflavoproteína que aceptaba electrones del NADH, con FAD como grupo postético y con molibdeno como probable componente metálico. Taniguchi y Ohmachi (1960) asilaron de células de Azotobacter vinelandii crecidas en nitrato una NADH-nitrato reductasa que se encontraba asociada a partículas y conectada a un sistema fuertemente aeróbico. La actividad de esta preparación de NADH-nitrato reductasa se Inhibía por el oxígeno y se estimulaba unas dos veces por la adición de FAD o FMN, aunque las flavinas no tenían efecto cuando el donador de electrones era el azul Nilo reducido. La actividad terminal era sensible a la azida y al clanuro, sugiriendo la existencia de algún metal pesado como constituyente del enzima. Excepto por su naturaleza particulada y el efecto inhibidor que sobre su actividad ejerce el oxígeno. La nitrato reductasa de A. vinelandii se asemeja bastante a la de hongos y plantas superiores, siendo aparentemente de tipo asimilatorio, ya que en su actuación no participan ninguno de los citocromos unidos a las partículas y asociados con la NADH-oxidasa.

    En este trabajo se ha hecho un estudio de los donadores de electrones y cofactores para la nitrato reductasa de A. chroococcum, así como de los inhibidores de esta actividad, encontrándose sensibles diferencias con respecto a la NAD(P)H-nitrato reductasa de organismos fotosintéticos y hongos.

    El enzima que cataliza el segundo paso de la reducción asimilatoria del nitrato, esto es la reducción del nitrito a amoniaco, en algas y plantas superiores se ha caracterizado en detalle durante los últimos años, ha viéndose clasificado como ferredoxina-nitrito reductasa (Beevers y Hageman, 1969; Hewitt, 1970; Kessler, 1971; Losada, 1972). La nitrito reductasa purificada hasta homogeneidad a partir de células de diferentes organismos fotosintéticos (Chlorella, hojas de espinaca y hojas de calabaza) contiene dos átomos de hierro en forma no hemínica pro molécula de 63.000 daltons, y paree no ser una flavoproteína (Losada y Paneque, 1971; Cárdenas et al., 1972a, b; Zumft, 1972). Por otra parte, el enzima aislado de los hongos asimiladores de nitrato Neurospora crassa (Nason et al., 1954; Nicholas et al., 1960) y Torulopsis nitratophila (Rivas et al., 1973) ha sido caracterizado como una NAD(P)H-nitrito reductasa que requiere específicamente FAD y parece tener algunos componentes metálicos.

    Como en el caso de la nitrato reductasa, pocos son los datos aportados hasta ahora acerca de las propiedades de la nitrito, reductasa de bacterias asimiladoras de nitrato (Nason, 1962; Takahashi et al., 1963; Hewitt y Nicholas, 1964) Spencer at al., (1957) encontraron en extractos de Azotobacter vinelandii un sistema soluble que reducía nitrito e hidroxilamina utilizando piridín nucleótidos reducidos como donadores de electrones, y que requería la adición de flavín nucleótidos para alcanzar la actividad máxima. Estudios con inhibidores indicaban que este sistema tenía un componente esencial para la actividad. El producto de la reducción del nitrito por los extractos se identificó como amoniaco, mientras que no pudo establecerse cual era el producto resultante de la reducción de la hidroxilamina. En células de la estirpe Bn de Escherichia coli obtenidas de cultivos sin agitación y con nitrato como única fuente de nitrógeno se han localizado por lo menos, tres nitrito reductasas que reducen el nitrito (y la hidroxilamina) a amoniaco (Lazzarini y Atkinson, 1961), aunque sólo el enzima específico para el NADH parece ser responsable de la reducción fisiológica de nitrito (Kemp y Atkison, 1966), Zarowny y Sanwall (1963) han observado también la existencia de una NADH-nitrito reductasa en extractos de células de E. coli K-12 crecidas con nitrato como fuente de nitrógeno. Prakash y Sadana (1972) han obtenido recientemente de Achromobacter fisherl cultivado en nitrato con bajas tensiones de oxígeno, una hemoproteína que catalizaba la reducción de nitrito (e hidroxilamina) a amoniaco; sin embargo, estos autores no llegaron a demostrar que el enzima desempeñase ninguna función biosintética.

    En este trabajo se han estudiado también diversas propiedades de la nitrito reductasa asimilatoria de A. chroococcum. Los resultados obtenidos indican que este enzima es bastante semejante al correspondiente de hongos, difiriendo sensiblemente en algunos aspectos de la ferredoxina-nitrito reductasa de algas y plantas superiores.

    La esencialidad del molibdeno como elementos traza de primordial importancia en la reducción del nitrógeno inorgánico se conoce desde hace más de 40 años. Borteis (1930) indicó ya la importancia de este metal en el proceso de la fijación del nitrógeno gaseoso, precisamente en la bacteria A. chroococcum, que es el organismos utilizado en el presente trabajo.

    La función bioquímica del molibdeno no se limita, sin embargo, a su papel en la fijación del nitrógeno molecular, sino que interviene también en la asimilación de nitrógeno nítrico. La primera prueba de que el molibdeno es esencial para la asimilación del nitrato se debe a Steinberg (1937), quien puso de manifiesto el requerimiento absoluto de este oligoelemento por Aspergillus niger, pero sólo cuando el hongo crece en medios con nitrato y no cuando utiliza amoniaco como fuente de nitrógeno. Desde entonces, muchos investigadores han demostrado que este metal es indispensable para un gran número de microorganismos y plantas (Hewiit, 1963; Nason y McElroy, 1963). En las algas clorofíceas Chlorella (Walker, 1953) y Scenedesmus (Arnon et al., 1955; Ichioka y Arnon, 1955), la función del molibdeno se limita exclusivamente a la reducción del nitrato, ya que el metal deja de ser indispensable para el crecimiento celular cuando se utiliza amoniaco o urea como fuente de nitrógeno.

    La inhibición competitiva y específica del tungsteno frente al molibdeno ha permitido profundizar más en el conocimiento del papel del molibdeno en la asimilación del nitrógeno inorgánico. Higgins et al., (1956) encontraron que el tungsteno es inhibidor competitivo del molibdeno en Aspergilus niger cuando el nitrato es la única fuente de nitrógeno. Experimentos similares en Azotobacter vinelandii (Keeler y Varner, 1957; Takahashi y Nason, 1957) demostraron que el volframio compite con el molibdeno tanto en la fijación de nitrógeno molecular como en la utilización del nitrato.

    Estudios a nivel celular y enzimático, que incluyen la utilización de tungstato y el empleo de radioisótopos, han permitido concluir que en Chiorella (Aparicio et al., 1971; Cárdenas et al., 1971; Vega et al., 1971; Paneque et al., 1972) y en plantas superiores (Heimer et al., 1969; Wray y Filner, 1970; Notton y Hewitt, 1971a, b) el molibdeno es un componente esencial de la nitrato reductasa de estos organismos. También en Neurospora se tenían evidencias de la asociación del molibdeno con la actividad nitrato reductasa (Garrett y Nason, 1967; Garrett y Nason, 1969).

    Sobre la ntirato reductasa de bacterias no existían experimentos concluyentes que demostraran la participación del molibdeno en su actividad. Los estudios con inhibidores han sugerido la participación de algún metal en la actividad del enzima de distintas especies, metal que en muchos casos se ha interpretado como molibdeno, quizás por establecer una similitud con la nitrato reductasa de hongos y organismos fotosintéticos. La escasez de resultados definitivos a este respecto nos ha llevado a la realización de experimentos que demuestran la intervención del molibdeno en la reducción enzimática de nitrato a nitrito, aclarando también la naturaleza del efecto inhibidor del tungsteno en la asimilación del nitrato por la bacteria A. chroococcum.

    Con respecto a la posible participación del hierro en los enzimas del sistema asimilador de nitrato en células fotosintéticas, se había sugerido su función como constituyente de la nitrito reductasa, aunque las evidencias de que se disponía hasta hace poco eran muy dudosas (Beevers y Hageman, 1969; Hewitt, 1970). Hucklesby et al., (1970) presumieron que el enzima de Chiorella, calabaza y espinaca debía contener hierro, basándose en el efecto que el cianuro y otros inhibidores de acción más específica sobre este metal tenían en la actividad nitrito reductasa de estos organismos. El que las deficiencias de hierro en calabaza y Chlorella se tradujesen en un disminución de su capacidad para reducir el nitrito, indujo a Kessler y Czygan (1968) a considera el posible contenido en hierro en enzima reductor de nitrito en estas especies. También en Neurospora, Nicholas et al., (1960) llegaron a proponer, aunque sin pruebas muy evidentes, que este metal era componente de la nitrito reductasa de este organismo. Hasta el momento, la participación del hierro en la funcionalidad de la nitrito reductasa de hongos y organismos fotosintéticos, sólo ha sido probada de manera clara y concluyente, tanto a nivel celular (Cárdenas et al., 1972c) como a nivel enzimático (Aparicio et al., 1971), para el enzima de Chlorella.

    En bacterias asimiladoras de nitrato, las pruebas que se tenían sobre la participación de metales, hierro entre ellos, en la nitrito reductasa, se limitaban a la interpretació del efecto de distintos inhibidores sobre la actividad enzimática (Nason et al., 1962; Prakash y Sadana, 1972), lo que dejaba el problema abierto a soluciones más concluyentes.

    En A. chroococcum hemos estudiado el papel del hierro en la asimilación de nitrato, concretando su esencialidad para el proceso de reducción del nitrito a amoniaco.

    La existencia de formas interconvertibles de los enzimas del sistema reductor del nitrato es un hecho que merece la mayor atención. La mitad terminal del complejo enzimático nitrato reductasa, tanto en células fotosintéticas (Jetschmann et al., 1972; Moreno et al., 1972; Maldonado et al., 1973) como en organismos no fotosintéticos (Pichinoty y Méténier, 1966; Rivas et al., 1973) se presenta en dos formas �activa e inactiva- que son interconvertibles. El paso de la forma activa a la inactiva requiere esencialmente la reducción del enzima, mientras que la reversión de este proceso (la conversión de la forma inactiva en activa) está sujeta a la reoxidación de la proteína (Losada, 1973). En la nitrato reductasa de Chlorella y Chlamydomonas, la interconversión entre estas formas no ocurre sólo en preparaciones enzimátias, sino que también se dá in vivo (Losada, 1970; Losada et al., 1970; Herrera et al., 1972; Losada, 1973), lo que señala el importante papel que este proceso de interconversión desempeña en la regulación fisiológica de la actividad de este enzima.

    Durante la caracterización de la nitrato reductasa de A. chroococcum hemos podido comprobar la posibilidad de inactivar de modo reversible este enzima. Al estudio de la interconversión de las formas activa e inactiva de esta nitrato reductasa se ha prestado la mayor atención en este trabajo.

    Aunque hasta el momento no existía ninguna comunicación acerca de la existencia de formas interconvertibles del enzima nitrito reductasa de organismos eucariontes, se disponía de una observación asilada, pero muy interesante al respecto, en el enzima de Escherichia coli (Kemp y Atkinson, 1966) que podía sugerir su ocurrencia en bacterias. Profundizando en este punto, hemos podido demostrar en la nitrito reductasa de A. chroococcum la interconversión entre las formas activa e inactiva del enzima.

    Como ha sido discutido por Herrera (1972), la regulación de la síntesis de los enzimas del sistema reductor del nitrato en diferentes organismos ha sido objeto de estudio por diversos investigadores, habiéndose llegado en algunos casos a conclusiones contradictorias, sobre todo en lo que a plantas superiores se refiere. En Chlorella (Losada et al., 1970, Losada, 1972) h Chlamydomonas (Herrera, 1972; Herrera et al., 1972), la síntesis de la nitrato reductasa y la nitrito reductasa se encuentra sometida a represión por el amoniaco. Morton y McMillan (1954) en Scopularlosis brevicaulis encontraron un bloque por parte del amoniaco de la reducción de nitrato a nitrito; el nitrito, sin embargo, se asimilaba aún en presencia de amoniaco. En Aspergillus nidulans (Pateman et al., 1967) tanto la nitrato como la nitrito reductasa se inducen por el nitrato, teniendo el amoniaco una acción represora sobre ambos enzimas. De modo análogo sucede en Neurospora crassa (Cook y Sorger, 1969; Garrett, 1972). En Hansenula anómala (Silver, 1957; Pichinoty y Méténier, 1966) se ha visto que la nitrato reductasa parece tener carácter inducible, aunque tanto la nitrato reductasa como la nitrito reductasa de Torulopsis nitratophila (Rivas, 1973) son represibles por el amoniaco.

    En bacterias asimiladoras de nitrato, las evidencias existentes, aunque no demasiado concluyentes, señalan la naturaleza inducible de los dos enzimas del sistema reductor de nitrato (Spencer et al., 1957; Taniguchi y Ohmachi, 1960).

    En A. chroococcum hemos estudiado este aspecto de la regulación de la síntesis de nitrato reductasa y nitrito reductasa, habiendo aclarado este punto de manera concluyente.

    Para el estudio de la asimilación de nitrógeno nítrico en microorganismos era esencial el poder disponer de un método preciso y muy sensible para la determinación de nitrato, que pudiera ser utilizado en el análisis de muestras de los cultivos y extractos celulares, por lo que ha sido necesario la puesta a punto de un método adecuado a estos propósitos.

    Aunque ya se habían descrito numerosos métodos químicos para la determinación de nitrato, la mayoría de ellos no son muy satisfactorios por estar sometidos a interferencias o presentar dificultades en su empleo, como han discutido Relimpio et al., (1972). Dado que la nitrato reductasa es un enzima altamente específico que reduce cuantitativamente el nitrato a nitrito puede emplearse como reactivo con propósitos analíticos. De acuerdo con esto se han descrito varios métodos, revisados por Relimpios et al., (1972), que utilizan: 1) una preparación de nitrato reductasa de determinadas estirpes de E. coli (que carecen de nitrito reductasa) con el empleo del sistema formato �azul de metileno-fórmico deshidrogenasa como donador de electrones; 2) células intactas de otros tipos de bacterias con un donador de electrones endógeno; y 3) bacteroides intactos de nódulos de soja con aporte exógeno de succinato como reductor. El nitrito formado se determinaba en todos los casos colorimétricamente por la reacción de Griess-llosvay. Nosotros hemos simplificado y mejorado los procedimientos anteiores, y evitado sus limitaciones, utilizando una preparación parcialmente purificada de NADH-nitrato reductasa de hojas de espinaca, que no ha de estar necesariamente exenta de nitrito reductasa.