Resumen de Purificación de catepsina l de 28 kda de fasciola hepatica

Luis Arias, G. Miryam López, Alvaro Marcelo Rodriguez

• español

  El presente trabajo tuvo como objetivo aislar la proteinasa de 28KDa a partir del parásito Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758). Esta cisteinil proteasa fue purificada por protocolos clásicos tales como la precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de exclusión molecular G-25, G-75, cromatografía de afinidad tiol sefarosa 4B y electroforesis SDS-PAGE al 12 %, siendo monitoreada la actividad enzimática en cada etapa de la purificación. La cisteinil proteinasa se observó como una banda homogénea y pura en el gel SDS-PAGE, la cual tiene una recuperación de 12,7%, 337,500 umol min-1 mg-1 de actividad específica y un número de 260 veces de purificación de la enzima respecto del extracto crudo. Mediante este esquema se purificó la catepsina L de 28 KDA a partir del regurgitado de una manera efectiva comparado con otras alternativas. La cantidad de proteína obtenida fue de 0,032 mg·mL-¹. La enzima migró como una banda homogénea durante la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS-PAGE al 12,5%, y el peso molecular determinado fue de aproximadamente 28 Kda de acuerdo a su movilidad relativa.

• English

  This work aims to isolate the 28KDa proteinase from the parasite Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758). This cysteinyl protease was purified by classical methods such as the ammonium sulphate precipitation, G-25 and G-75 gel filtration chromatographies, affinity chromatography with thiol sepharose 4B and SDS-PAGE 12% electrophoresis. The enzymatic activity of Cathepsin L was monitored in each step of purification using a specific substrate. The cysteine proteinase was observed as a pure and homogenous band in the SDS-PAGE gel. The recovery percentage was 12.7%, with a specific activity of 337,500 umol, min-1 mg-1 and a purification factor of the enzyme of 260. Using this simple scheme of purification we purified to homogeneity the cathepsin L of 28KDa from the regurgitate in an effective way compared with other alternative methods. The amount of protein obtained was 0.032 mg·mL-¹. The enzyme showed as a homogenous band during the electrophoresis in polyacrylamide gel with 12.5% SDS-PAGE and the molecular weight was 28 kDa according to its relative mobility.