Avances en el conocimiento de la cromogranina A y otros biomarcadores salivares de estrés en cerdos= Advances in the knowledge of chromogranin A and other salivary biomarkers of stress in pigs

Abstract

Esta tesis doctoral, por compendio de artículos, ha sido diseñada con el fin de producir avances en la medición de biomarcadores de estrés y para desarrollar y validar un panel de biomarcadores salivares para evaluar los diferentes sistemas fisiológicos (simpático-adrenomedular (SAM), hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), hipotálamo-pituitario-gonadal (HPG) y sistema inmune) que participan en el mecanismo de estrés. Para ello, los objetivos de esta tesis son los siguientes: desarrollar y validar un ensayo inmunofluorométrico a tiempo resuelto (TR-IFMA) para las mediciones de cromogranina A (CgA) salivar porcina, utilizando un anticuerpo específico de la especie, y evaluar su comportamiento como posible biomarcador del sistema SAM en un modelo de estrés agudo. Además, estudiar si las concentraciones de CgA salivar exhiben un patrón circadiano durante el día, y evaluar su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Por otra parte, validar inmunoensayos disponibles comercialmente para la cuantificación de cortisol (biomarcador del sistema HPA), testosterona (biomarcador del sistema HPG) e IgA (biomarcador del sistema inmune) en la saliva de los cerdos. Evaluar la respuesta de un panel de varios biomarcadores salivares tanto del sistema inmune como del sistema neuroendocrino a la administración repetida de Escherichia coli lipopolisacárido (LPS) y, por último, investigar la respuesta de todo este grupo de biomarcadores salivares después de aplicar un modelo de estrés psicosocial en cerdos basado en el aislamiento y el reagrupamiento. En cuanto a la metodología empleada, los anticuerpos policlonales específicos producidos para el desarrollo del TR-IFMA fueron obtenidos mediante la inmunización con un péptido recombinante de proteína CgA porcina. La precisión, exactitud y sensibilidad analítica del TR-IFMA desarrollado y de los inmunoensayos comerciales empleados fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e interensayo, la linealidad bajo dilución y el porcentaje de recuperación, el límite de detección y los límites de cuantificación. Para estudiar la respuesta de los biomarcadores salivares frente al estrés se emplearon modelos en los que los animales fueron inmovilizados con un acial o transportados a matadero. Tomando muestras de saliva antes y después de aplicar dichos estímulos estresantes. Por otro lado, en el caso de la administración de LPS, los cerdos que fueron utilizados recibieron tres dosis de LPS en intervalos de 48 h. Las muestras de saliva fueron tomadas antes de la administración de LPS y 3 h después de cada una de las administraciones. Por otra parte, en el modelo de aislamiento y reagrupamiento todos los animales se adaptaron a la vida en grupo durante 5 días, después de lo cual, un grupo de cerdos fueron sometidos al procedimiento de aislamiento, donde los animales permanecieron sin contacto físico con otros cerdos durante 5 días. Después, los cerdos del ensayo se reagruparon de nuevo durante 3 días, regresando a las condiciones iniciales. Los cerdos controles permanecieron en las mismas condiciones durante todo el estudio. Las muestras de saliva se tomaron diariamente, a la misma hora, y un muestreo adicional fue realizado a los 30 min tras los procedimientos de aislamiento y reagrupado. En general, nosotros podemos concluir de este trabajo que: el TR-IFMA desarrollado permite la cuantificación de CgA en muestras de saliva porcina de una forma precisa, exacta y sensible y su concentración aumenta significativamente después de una situación de estrés agudo. Además, no ha sido detectado un patrón circadiano para la CgA salivar y este biomarcador fue bastante estable, siendo posible su almacenamiento hasta un año a -20ºC o -80ºC. Por otra parte, los inmunoensayos comerciales validados para las concentraciones de cortisol, testosterona e IgA pueden ser utilizados para su uso en muestras de saliva de cerdos con una buena precisión, sensibilidad y exactitud. En cuanto a la administración de LPS, una sola administración en cerdos produce incrementos de IgA salivar y cortisol. Sin embargo, administraciones repetidas solo producen incrementos en IgA mientras que el cortisol retorna a valores basales. No se observaron variaciones en las concentraciones de CgA ni con una sola administración ni con administraciones repetidas. Finalmente, el uso de un panel de biomarcadores salivares podría ser esencial en la investigación de estrés, ya que estos reaccionan de manera diferente a diversos tipos de factores estresantes. En el caso del aislamiento, CgA e IgA parecen ser marcadores más sensibles que el cortisol y la testosterona, mientras que después del proceso de reagrupado, el cortisol, la testosterona y la CgA parecen ser marcadores más sensibles que la IgA.

Abstract This PhD thesis, for compendium of articles, was designed in order to produce advances in the measurement of salivary biomarkers of stress and to develop and validate a panel of salivary biomarkers to evaluate the different physiological systems (sympatho-adrenomedullary (SAM), hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG) and immune system) that are taking part in stress mechanism. To this end, the objectives of this thesis are: to develop and validate a time-resolved immunofluorometric assay (TR-IFMA) for porcine salivary chromogranin A (CgA) measurements, using a species-specific antibody, and evaluate its behaviour as a potential biomarkers of SAM system in an acute stress model. In addition, to study if salivary CgA concentrations exhibit any circadian pattern during the daytime, and to evaluate its stability under different storage conditions. Moreover, validate commercially available immunoassays for cortisol (HPA system biomarker), testosterone (HPG system biomarker) and IgA (immune biomarker) quantification on the saliva of pigs. To evaluate the response of a panel of several salivary biomarkers both of immune system as well as of the neuroendocrine system to repeated administration of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) and, finally, to investigate the responses of this group of salivary biomarkers after applying a psychosocial stressor model in pigs based on isolation and regrouping. Regarding the methodology, polyclonal antibodies specific for the development of TR-IFMA were produced in rabbits immunized with a recombinant protein peptide of CgA porcine. Precision, accuracy and analytical sensitivity of the TR-IFMA developed and of the commercial immunoassays used were evaluated by the coefficients of variation intra- and inter-assay, linearity under dilution and the percentage of recovery, limits of detection and limits of quantitation. To study the stress response of salivary biomarkers, models in which the animals were immobilized with a nose-snare or transported to slaughterhouse were used. Saliva samples were taken before and after of applying these stressful stimuli. On the other hand, in the case of LPS administrations, the pigs were selected to receive three doses of LPS at 48 h intervals. Saliva samples were taken prior to any LPS administration and at time points corresponding to 3 h after each injection. Moreover, in the model of isolation and regrouping all animals were adapted to group living for 5 days, after which time, pigs in one group were subjected to the isolation procedure, where each animal had not physical contact with other pigs during 5 days. After, test pigs were regrouped again during 3 days returning to the initial conditions. Control pigs were remained in the same housing condition during the entire experimental period. Saliva samples were taken daily, at the same time, and one sampling was carried out at 30 min after of isolation and regrouping events. In overall, we can conclude of this work that: the TR-IFMA developed allows the quantification of CgA in porcine saliva samples in a precise, accurate and sensitive way and its concentrations increase after an acute stress situation. In addition, no circadian pattern has been detected for salivary CgA and this biomarker was fairly stable being able to be stored till 1 year at -20ºC or -80ºC. Moreover, the commercial immunoassays validated for cortisol, testosterone and IgA concentrations can be suitable for its use in saliva samples of pigs with a good precision, sensitivity and accuracy. In relation to LPS administrations, a single administration in pigs produces increases of salivary IgA and cortisol. However, repeated administrations only produced increases in IgA whereas cortisol returned to baseline values. No variation in CgA concentrations were observed neither in single nor in repeated LPS administration. Finally, the use of a panel of salivary biomarkers would be essential in stress research, since these react differently to various types of stressors. In the case of isolation, CgA and IgA appear to be more sensitive markers than cortisol and testosterone, whereas after the process of regrouped, cortisol, testosterone and CgA seem to be more sensitive markers than IgA.