Estudios sobre alfa-amilasa en saliva como marcador de estrés en la especie humana y otras especies animales= Studies on salivary alpha-amylase as a maker of stress in human and different animal species

Abstract

OBJETIVOS 1. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en humana, usando como modelo experimental a estudiantes de veterinaria que tenían que realizar una presentación oral de un trabajo en lengua extranjera.

2. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en cerdos.

3. Implementar nuevos enfoques para la medición de la alfa-amilasa en muestras de saliva de varias especies (incluidos los seres humanos) mediante la cuantificación directa de la cantidad de la alfa-amilasa salival en lugar de mediante la medición de su actividad

4. Detectar e identificar nuevos biomarcadores de estrés en la saliva mediante técnicas de proteómica. Una técnica avanzada que permite la separación e identificación de múltiples proteínas.

METODOLOGÍA Esta tesis doctoral es un compendio de los siguientes artículos publicados:

1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print].

2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7.

3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32.

En el primer artículo, se midió el cortisol salival y la actividad alfa-amilasa para evaluar el estrés asociado con una presentación oral pública de los estudiantes de Patología Clínica Veterinaria. Se recogieron muestras de saliva antes y directamente después de la presentación oral de 5 minutos y a los 20 y 35 minutos después del comienzo de la misma. El cortisol alcanzó su punto máximo 20 minutos después del comienzo de la presentación, mientras que la alfa-amilasa salival alcanzó su máximo justo al final del discurso. No existió relación entre estos cambios y el nivel de estrés que se indica por el estudiante en un cuestionario, ni con el sexo del estudiante, o la calidad de la presentación. El objetivo del segundo estudio fue validar un método espectrofotométrico automatizado para la medición de alfa-amilasa salival en cerdos y evaluar su posible aplicación como biomarcador de estrés no invasivo . La validación analítica incluyó la precisión intra- e inter- ensayo, linealidad bajo dilución, y límite de detección. Además, para estudiar el posible uso de alfa- amilasa salival como marcador de estrés, 12 cerdos en crecimiento de 3-4 meses de edad fueron sometidos a estrés por inmovilización durante al menos 1 min, obteniéndose muestras de saliva en diferentes puntos de tiempo. Los resultados de la validación analítica indicaron que el método era preciso y capaz de medir la alfa-amilasa de una manera lineal. Los resultados obtenidos en la prueba de esfuerzo mostraron un aumento significativo en la actividad salival alfa amilasa. El propósito del artículo 3 fue estudiar los cambios en el proteoma salival de cerdos sanos en situaciones de estrés para identificar cualquier posible nuevo biomarcador salival de estrés. Tres grupos de animales fueron sometidos a 3 modelos de estrés: restricción seguido de muestreo simulado de sangre de la vena cava; transporte breve por carretera; restricción de movimiento en una jaula digestibilidad. La saliva se obtuvo de cada animal antes, 15 y 30 min después de la inducción de estrés. Las muestras de los animales que mostraron el mayor incremento en la concentración de cortisol salivar se agruparon y se realizó una electroforesis en geles bidimensionales. Se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250 para la detección de spots y seleccionarlos para su identificación mediante espectrometría de masas. Los análisis estadísticos demostraron que 2 proteínas tenían diferencias significativas en la expresión antes y después de la inducción de estrés y fueron identificadas como fragmentos de albúmina y proteína de unión odorizante. CONCLUSIONES

1. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en estudiantes de Veterinaria tras someter a los individuos a una presentación pública oral.

2. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en cerdos tras someter a los individuos a un protocolo de restricción de movimientos.

3. La concentración de alfa amilasa en saliva de humanos, cerdos, caballos y ovejas puede ser cuantificada mediante un ensayo de inmunofluorometría a tiempo resuelto. Este ensayo tiene una variación inter-individual baja y es más sensible que los ensayos enzimáticos para detectar estrés.

4. El proteoma salivar de los cerdos ha revelado diferencias entre animales en condiciones basales y bajo condiciones de estrés. Esto se reveló como una herramienta útil para buscar posibles nuevos biomarcadores de estrés in estos animales tales como la proteína de unión odorizante. OBJECTIVES 1. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in human using a model in which veterinary students had to make an oral presentation in a foreing language.

2. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in pigs.

3. To implement new approaches for measuring alpha-amylase in saliva samples of several species (including human beings) by direct quantification of the amount of the salivary alpha-amylase instead of by measuring its activity (Article 3, Article 4, Article 5, Article 6).

4. To detect and identify new biomarkers of stress in saliva by proteomics. An advanced technique that allows separation and identification of multiple proteins.

METHODOLOGY This PhD thesis is a compilation of the following published papers:

1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print].

2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7.

3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32.

In the first article, salivary cortisol and alpha-amylase activity were measured to assess stress associated with a public oral presentation in Veterinary Clinical Pathology students. Stimulated saliva samples were collected before and directly after a 5-minute oral presentation and at 20 and 35 minutes after the beginning of the presentation. Cortisol peaked 20 minutes after the beginning of the presentation, whereas salivary alpha-amylase (sAA) peaked at 5 minutes, just at the end of the speech. These changes were not related to the level of stress that was indicated by the student in a questionnaire, the student’s sex, or the quality of the presentation. The aim of the second study was to validate an automated spectrophotometric method for salivary alpha-amylase measurement in pigs and evaluate its possible application as a noninvasive stress biomarker. The analytical validation included intra- and interassay precision, linearity under dilution, and limit of detection. In addition, to study the possible use of salivary alpha-amylase as a possible stress marker, 12 crossbred growing pigs of 3-4 months of age were subjected to restraint stress by a nasal snare for at least 1 min, and saliva samples were obtained at different time points. The results of analytical validation indicated that the method was precise and able to measure alpha-amylase in a linear manner. The results obtained in the stress test showed a significant increase in salivary alpha-amylase activity. The purpose of the research of article 3 was to study changes in the salivary proteome of healthy pigs in stressful situations to identify any potential new salivary biomarker of stress. Three groups of animals were subjected to 3 stress models: snaring restraint followed by simulated sampling of vena cava blood; brief transport by road; and restriction of movement in a digestibility cage. Saliva was obtained from each animal before and 15 and 30 min after the induction of stress. The samples from the animals that showed the greatest increase in salivary cortisol concentration were pooled and run on 2-dimensional gels. Coomassie Brilliant Blue R-250 was used for spot detection and mass spectrometry for spot identification. Statistical analyses showed that 2 proteins had significant differences in expression before and after the induction of stress. These proteins were identified as odorant-binding protein and fragments of albumin. CONCLUSIONS

1. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in Veterinary students after subjecting the individuals to a public oral presentation.

2. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in pigs after subjecting the individuals to restraint of movement protocol.

3. Alpha-amylase concentration in saliva of humans, pigs, horses and sheep can be quantified by TR-IFMA This assay has a lower inter-individual variation and is more sensitive than enzymatic assays to detect stress.

4. Salivary proteome of pigs has revealed differences between animals in basal status and under stress conditions. It was shown as a useful tool to search possible new salivary biomarkers of stress in these animals such as odorant-binding protein.