Search for new antiviral compounds using fragment screening methodology

• Autores: Zuzanna Kaczmarska
• Directores de la Tesis: Miquel Coll Capella (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ernest Giralt Lledó (presid.), Núria Verdaguer Massana (secret.), Albert Canals Parera (voc.)
• Materias:
  • Física
    • Física del estado sólido
      • Cristalografía
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Los Picornaviridae son una de las familias de virus más diversas y conocidas desde hace más tiempo. Esta familia incluye importantes agentes patógenos que afectan a humanos y a animales. Los Picornaviridae son virus pequeños, icosaédricos, de ARN de cadena sencilla de sentido positivo y causan una gran variedad de enfermedades, tales como encefalitis y poliomielitis. Se dispone de vacunas para el poliovirus, el virus de la hepatitis A y el virus de la fiebre aftosa, pero no se ha implementado ninguna profilaxis efectiva para otros picornavirus. Hasta ahora, la investigación antiviral se ha centrado en la cápside, mientras que los inhibidores dirigidos a proteínas no estructurales (como las proteasas, las helicasas y las polimerasas) están todavía por explorar. Este proyecto se centró en la caracterización estructural y bioquímica de la proteasa 3C de enterovirus B93 (EV-B93) y de los complejos de esta proteasa con varios inhibidores covalentes. El segundo objetivo fue conseguir inhibidores no covalentes de la proteasa EV-B93 3C y realizar una caracterización bioquímica, antiviral y estructural de los complejos de EV-B93 3C con estos inhibidores. La actividad proteolítica de la proteasa EV-B93 3C se caracterizó in vitro en presencia y en ausencia de dos inhibidores covalentes ya conocidos, el rupintrivir y el compuesto 1. La actividad también se caracterizó en presencia de otros tres inhibidores covalentes de bajo peso molecular: NZO, NZN y el DB5_60. Se determinaron las estructuras cristalinas de la proteasa EV-B93C y de los complejos de la proteasa EV-B93C con el rupintrivir, con el compuesto 1 y con la molécula NZN con resoluciones de 1,57, 1,50, 1,32 y de 1,73 Å, respectivamente. Las estructuras mostraron que, de forma similar a otras proteasas 3C de picornavirus, la proteína adopta un patrón de plegamiento similar a la quimiotripsina y que los residuos His-40, Glu-71 y Cys-147 conforman una tríada catalítica Se seleccionaron inhibidores no covalentes de la proteasa EV-B93 3C mediante NMR-based fragment screening. Los resultados se validaron mediante ensayos de desplazamiento térmico (TSA, del inglés thermal shift assay), resonancia de plasmones superficiales (SPR, del inglés surface plasmon resonance) y ensayos de actividad proteolítica. Se eligió el mejor compuesto y se evaluó la actividad proteolítica in-vitro de 44 análogos de esta molécula. El análogo más potente presentó un IC50 de 5 ¿M. Tras una optimización química, se halló un inhibidor más eficiente que también presentaba un IC50 de 5 ¿M. La actividad inhibidora de los cuatro compuestos seleccionados y del compuesto optimizado se evaluó en ensayos proteolíticos in vitro con cinco proteasas análogas de la proteasa 3C de los siguientes virus: rinovirus humano A49 (HRV-A49), enterovirus D68 (EV¿D68), virus aichi A (AiV), sapelovirus porcino (PSV) y virus de la rinitis equina B (ERBV-1). En estos estudios se observó inhibición de AiV, SPV y ERBV-1. Sin embargo, estos compuestos no presentaron actividad proteolítica o antiviral en cultivos celulares, lo que podría ser debido a la falta de permeabilidad celular, a la baja solubilidad y/o a la alta toxicidad de los compuestos. Se llevaron a cabo ensayos de co-cristalización y de soaking de la proteasa EV-B93 3C con los compuestos más prometedores, para así poder obtener la estructura cristalina de la proteasa con los inhibidores no covalentes. Por desgracia, no se observó densidad electrónica adicional en el sitio activo de la proteasa EV-B93 3C. En estudios bioinformáticos de docking se observó que el compuesto optimizado podría unirse a la proteasa. Según estos análisis, el compuesto se uniría varias cavidades de la proteína e interaccionaría con dos de los residuos que conforman la tríada catalítica El compuesto optimizado es una molécula relativamente grande y rígida, incapaz de unirse a la proteasa sin que ésta cambie su conformación previamente y este cambio de conformación es difícil en el estado cristalino de la proteína. Esto explicaría la incapacidad de la molécula de cristalizar con la proteasa EV-B93 3C. Los resultados obtenidos en este estudio podrían ayudar a diseñar antivirales no covalentes potentes de las proteasas 3C enterovirales.