Resumen de Structural and functional studies on the regulation of the USP28 de-ubiquitinase and the SENP5 de-SUMOylase

Zhen Yang

• USP28 és un enzim de-ubiquitinasa (DUBs), homologa a USP25, que pertany a la família USPs. USP28 s’ha involucrat en apoptosis induïda per IR i en l’estabilitat de vari regulador de DDR (Reparació de Dany al DNA). D’altra banda, SENP5 és una proteasa especifica per Sentrin/SUMO de la família de SENP, que s’ha descrit que està involucrada en mitosi i citocinesi. En aquesta tesi, el principal objectiu ha estat la resolució de les seves estructures cristal·lines i la caracterització de la regulació de la seva activitat proteolítica. Respecte a la part de USP28, hem aconseguit produir diferent constructes del seu Domini Catalític (CD) i de la regió N-terminal (NT), i hem caracteritzat les seves activitats sobre diferent substrats poli-Ubiquitina. També hem identificat el lloc de SUMOilització primari de USP28 per Espectrometria de Masses (K99). També hem aconseguit obtenir cristalls del NT de USP28 i del CD de USP25. Desafortunadament, la difracció d’aquests cristalls és dèbil i la seva estructura no s’ha pogut resoldre. També hem identificat l’especificitat de cadena di-Ubiquitin en USP28 (K11, K48 i K63 cadenes). Els nostres assajos in vitro indiquen que l’activitat proteolítica de USP28 es pot regular per modificació covalent per SUMO a la regió N-terminal. De totes formes, la presencia de la regió N-terminal no és estrictament necessària per l’activitat USP28. Si considerem que tenim un domini SIM, un domini UBA i dos dominis UIMs a la regió N-terminal, fóra interessant estudiar aquest aspecte amb més detall en el futur. Respecte a la part de SENP, hem posat molts esforços en la producció d’una construcció soluble del Domini Catalític (CD) de SENP3 i SENP5. Finalment, hem aconseguit produir en grans quantitats un constructe soluble de SENP5-CD en E.coli. Hem caracteritzat in vitro les reaccions de processament de SUMO i de deconjugació de SUMO. També ham format complexes entre un mutant inactiu de SENP5-CD-C712S amb el precursor de SUMO2 (Sp5-S2p) i amb el substrat RanGAP1-SUMO2. Només hem aconseguit obtenir cristalls de Sp5-S2p, malauradament la difracció era tan dèbil que no hem pogut resoldre l’estructura a alta resolució.