Affinity bioseparation and biosensing using magnetic particles for food safety
- Autores: Susana Liébana Girona
- Directores de la Tesis: Salvador Alegret Sanromà (dir. tes.), María Isabel Pividori (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2013
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Danila Moscone (presid.), Maria del Pilar Marco Colas (secret.), Rosa Puchades (voc.)
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- Resumen
La presente Tesis describe el diseño y la evaluación de nuevas estrategias, tanto ópticas como electroquímicas, para la detección rápida de bacterias patógenas en seguridad alimentaria. En la misma, se evalúan diferentes plataformas electroquímicas, basadas principalmente en biocompósitos de grafito-epoxi así como en el acoplamiento de partículas magnéticas a compósitos de grafito-epoxi. Las partículas magnéticas utilizadas permitieron la inmovilización covalente del bioreceptor en su superficie, tales como partículas magnéticas modificadas con estreptavidina, anticuerpos o bacteriófagos, así como también la inmovilización electroestática del analito mediante las partículas magnéticas de sílice. De este modo, se estudiaron diversas interacciones de bioafinidad tales como biotina-avidina, anticuerpo-antígeno y bacteriófago-receptores de superficie bacterianos. En primer lugar, se evaluó un método rápido de cribado para la tuberculosis bovina en leche y productos lácteos basado en un genosensor electroquímico de ADN específico para M. bovis. En este estudio se evaluaron dos plataformas: i) biocompósitos grafito-epoxi de avidina (Av-GEB), y ii) magneto-electrodos basados en compósitos grafito-epoxi (m-GEC) acoplados a partículas magnéticas. Se determinaron muestras de leche provenientes de granjas y se compararon con el test de tuberculina, así como en un ensayo inter-laboratorio de PCR. A continuación se estudiaron diferentes estrategias bioanalíticas para la detección de bacterias patógenas utilizando Salmonella como modelo. La primera estrategia se basa en un doble bioreconocimiento de la bacteria, i.e. inmunológico y genético. Las bacterias fueron capturadas y pre-concentradas de muestras alimentarias mediante partículas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico para Salmonella a través de la reacción inmunológica. Tras la separación inmunomagnética, las bacterias capturadas fueron lisadas y el ADN amplificado específicamente mediante PCR con cebadores doblemente marcados. Por último, el amplicon fue detectado mediante un magneto-genosensor electroquímico. La segunda estrategia se basó, por primera vez, en el uso de bacteriófagos como elemento de bioreconocimiento en la separación magnética de bacterias patógenas. Así, se exploró el potencial de los fagos tomando como modelo el fago P22 específico para Salmonella, el cual se inmovilizó de forma orientada sobre las partículas magnéticas. A continuación las bacterias fueron capturadas y pre-concentradas mediante las partículas modificadas a través de la interacción fago-huésped. Para confirmar la identidad de las bacterias se procedió a la amplificación del ADN mediante PCR de doble marcación y detección mediante un magneto-genosensor electroquímico. La tercera estrategia presentada para detección de Salmonella se basó en la detección de la célula entera mediante un doble reconocimiento inmunológico. Las bacterias fueron capturadas y pre-concentradas de muestras alimentarias mediante separación inmunomagnética. A continuación, la marcación enzimática se realizó mediante un segundo anticuerpo específico para Salmonella, llevándose a cabo de este modo la detección mediante un magneto-inmunosensor electroquímico. Aunque los límites de detección obtenidos fueron superiores, el tiempo de ensayo y la complejidad del procedimiento fueron reducidos considerablemente. Las características analíticas de esta estrategia fueron evaluadas no solo para detección electroquímica sino también óptica, desarrollando de este modo un magneto-inmunoensayo óptico como última estrategia presentada para detección de Salmonella. Finalmente, la última estrategia desarrollada en la Tesis se basó en la detección de los tres patógenos más frecuentes en seguridad alimentaria (Salmonella, Listeria y E. coli) mediante un magneto-genosensor electroquímico. Tras la extracción del genoma bacteriano se realizó la amplificación de este mediante PCR utilizando cebadores con tres marcas diferentes. Los amplicones marcados fueron inmovilizados en partículas magnéticas de sílice y posteriormente detectados electroquímicamente. Cabe destacar que biosensores basados en las estrategias presentadas en esta Tesis son herramientas ideales para ser utilizados en la detección rápida, económica y sensible del riesgo de contaminación de patógenos en una gran variedad de matrices.
