Estudios estructurales de relaxasas involucradas en el proceso de conjugación bacteriana
Russi, Silvia
Coll Capella, Miquel, dir. (Institut de Biologia Molecular de Barcelona)
Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i de Fisiologia

Publicació:	Bellaterra: Universitat Autònoma de Barcelona, 2010
Resum:	La conjugación bacteriana es uno de los mecanismos de transferencia horizontal genética más importante y la causa principal de la rápida adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias. La capacidad de las bacterias para conjugarse fue descubierta en 1946 en cultivos de E. coli y, años más tarde, en bacterias Gram-positivas. El proceso de conjugación comienza con el corte de un enlace fosfo-diester específico por medio de una relaxasa que juega un papel clave en la iniciación de dicha transferencia. En el plásmido R388 de E. coli, TrwC es la transferasa que cataliza la etapa inicial y final de la transferencia conjugativa del ADN. La estructura cristalina del dominio N-terminal de la relaxasa TrwC en complejo con un oligonucleótico de 27 bases que contiene la horquilla de reconocimiento y el enlace fosfo-diester a cortar ha sido determinada por difracción de rayos X. Asimismo, se han resuelto las estructuras de una serie de complejos ternarios proteína-ADN-metal con diferentes cationes divalentes ocupando el sitio activo. Un análisis sistemático, mediante difracción anómala, permitió determinar sin ambigüedad la naturaleza del metal localizado en el sitio activo, encontrándose que Zn2+, Ni2+ y Cu2+ se unían a la tríada de histidinas. La comparación de las estructuras de los diferentes complejos sugiere la existencia de dos caminos que permiten la salida de la cadena de ADN del centro activo y que probablemente son utilizados en diferentes etapas de la reacción de proceso de conjugación. La información estructural permitió proponer (i) un mecanismo enzimático en el que el ión metálico polariza el enlace fosfo-diester a cortar facilitando el ataque por parte de la tirosina catalítica, y (ii) la serie de eventos que ocurren durante el procesamiento del ADN a transferir y que explican la función biológica de la relaxasa. Asimismo se ha estudiado y caracterizado por difracción de rayos X el dominio N-terminal de la relaxasa MobM del plásmido pMV158 de Streptococcus agalactiae en complejo con un oligonucleótido de 26 bases que mimetiza la secuencia del oriT justo hasta el sitio de corte (nic). El plegamiento global de la proteína muestra un núcleo central formado por cinco hebras betas anti-paralelas flanqueadas por dos pares de hélices alfa. Este plegamiento es estructuralmente homólogo al observado en la relaxasas de bacterias Gram-negativas, pese a la baja homología de secuencia existente entre dichas proteínas. La cadena de ADN se une a MobM mediante numerosas interacciones electrostáticas alojándose a lo largo de la amplia cavidad que la superficie de la proteína presenta. Los contactos intermoleculares se agrupan en cuatro regiones; los dos más importantes involucran dos giros betas consecutivos de la cadena proteica que penetra en el surco menor del ADN y un largo lazo flexible que rodea el extremo de simple cadena del ADN.
Resum:	Bacterial conjugation is one of the most important horizontal gene transfer mechanisms and the main cause of the rapidly spread of the antibiotic resistance in bacteria. The ability of bacteria to conjugate was discovered in 1946 in E. coli cultures and years later in Gram-positive bacteria. The conjugative process begins with the cleavage of a specific phosphodiester bond through a relaxase protein, playing a key role in the initiation of the transfer. TrwC is the DNA strand transferase that catalyzes the initial and final stages of conjugative DNA transfer in the plasmid R388 from E. coli. We have solved the crystal structure of the N-terminal relaxase domain of TrwC in complex with a 27 base-long DNA oligonucleotide that contains both the recognition hairpin and the scissile phosphate. In addition, a series of ternary structures of protein-DNA complexes with different divalent cations at the active site have been solved. Systematic anomalous difference analysis allowed us to determine unambiguously the nature of the metal bound. Zn2+, Ni2+ and Cu2+ were found to bind the histidine-triad metal binding site. Comparison of the structures of the different complexes suggests two pathways for the DNA to exit the active pocket. They are probably used at different steps of the conjugative DNA-processing reaction. The structural information allows us to propose (i) an enzyme mechanism where the scissile phosphate is polarized by the metal ion facilitating the nucleophilic attack of the catalytic tyrosine, and (ii) a probable sequence of events during conjugative DNA processing that explains the biological function of the relaxase.
Nota:	Descripció del recurs: el 1 de febrer de 2011
Nota:	Als preliminars: El presente trabajo se ha realizado en el Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona)
Nota:	Tesi doctoral - Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Biotecnologia i de Biomedicina, 2009
Nota:	Bibliografia
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Llengua:	Castellà
Document:	Tesi doctoral
Matèria:	Plasmidis ; Conjugació (Biologia) ; Bacteris gramnegatius ; Bacteris grampositius
ISBN:	978-84-693-0391-7

Adreça alternativa:: https://hdl.handle.net/10803/3835

132 p, 4.6 MB

53 p, 9.1 MB

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