Caracterización molecular del bacteriófago BAM35. Mecanismo de replicación del DNA y estudio del interactoma proteico
Author
Berjón Otero, Mónica RosaEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)Date
2017-02-17Subjects
Bacteriófagos - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-02-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 17-08-2018
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Los miembros de la familia Tectiviridae se clasifican en dos grupos: fagos líticos que infectan a bacterias
Gram-negativas y fagos atemperados cuyo hospedador son bacterias Gram-positivas. Mientras que el primer
grupo, y más concretamente PRD1, ha sido ampliamente estudiado, no se conoce en detalle la biología de
los bacteriófagos pertenecientes al segundo grupo. Con el objetivo de ampliar el conocimiento científico de
los tectivirus que infectan a Gram-positivas y establecer un nuevo modelo de estudio dentro de este grupo,
el presente trabajo se focalizó en el estudio de la replicación del genoma y de la interacción entre todas las
proteínas del bacteriófago Bam35.
La DNA polimerasa de Bam35 (B35DNAP), codificada por el marco de lectura abierto 5 (ORF5) de su genoma,
pertenece a la familia B y presenta los subdominios TPR1 y TPR2, característicos de las DNA polimerasas
(DNAPs) que inician la replicación del material genético utilizando una proteína terminal (TP) como primer.
La caracterización bioquímica de esta enzima mostró una polimerización altamente procesiva asociada al
desplazamiento de banda. Además, posee actividad exonucleasa 3´-5´que actúa de manera coordinada con
la actividad polimerasa y que, junto a la especificidad de inserción del nucleótido dictado por la hebra
molde, le confiere una fidelidad comparable con la de otras DNAPs replicativas, como las habitualmente
empleadas para amplificar DNA.
A pesar de su alta fidelidad, la B35DNAP es también capaz de replicar un molde de DNA con sitios abásicos
insertando, preferentemente, una adenina enfrente del daño y sin producir cambios en el marco de lectura.
Además, la deleción del subdominio TPR2, requerido para la procesividad, impide la extensión del primer
más allá del daño.
Por otro lado, la caracterización funcional y bioquímica de la proteína codificada por el ORF4 del genoma
de Bam35 demostró que dicha proteína es la TP viral, que actúa como primer en la replicación. La B35DNAP
utiliza la tercera base del extremo 3´ del DNA como molde para catalizar la formación de un enlace fosfoéster
entre el nucleótido complementario y el grupo OH de la tirosina 194 de la TP. A continuación, el complejo de
iniciación se puede translocar hacia atrás mediante un nuevo mecanismo de jumping-back de un nucleótido
para recuperar la información genética del extremo.
Por último, el presente estudio muestra la información obtenida del análisis generalizado entre las
interacciones de las proteínas codificadas por el genoma de Bam35. Los datos obtenidos nos permiten
proponer a la proteína P17 como proteína minoritaria de la cápsida y a la P24 como proteína del pentón.
Además, la proteína hidrolítica de la membrana interna P26 podría tener una función estructural clave,
ya que interacciona tanto con otras proteínas de membrana como con proteínas del pentón y del vértice
especial. Por último, en las demás interacciones observadas están implicadas 10 proteínas más de función
aún desconocida. The members of the Tectiviridae family can be subdivided into two groups: lytic bacteriophages that
infect Gram-negative bacteria and temperate phages whose hosts are Gram-positive bacteria. While the
first group, namely PRD1, has been deeply studied, the biology of the bacteriophages belong to the second
group is not well known. Therefore, to extend the knowledge of the tectiviruses that infect Gram-positive
bacteria and to establish a new working model for this group, the present work is focused on the study of
the genome replication and the protein-protein interactions of the Bam35 bacteriophage.
The Bam35 DNA polymerase (B35DNAP), encoded by the open reading frame 5 (ORF5) of its genome,
belongs to the B family and contains the TPR1 and TPR2 subdomains, which are the hallmark of DNA
polymerases (DNAPs) that initiate the replication using a terminal protein (TP) as a primer. The biochemical
characterization of this enzyme showed a highly processive polymerization coupled to strand displacement.
In addition, the B35DNAP has a 3´-5´ exonuclease activity that acts in a coordinated manner with the
polymerization activity. This activity, together with the specificity of insertion of the nucleotide dictated by
the template strand, provides to the B35DNAP a fidelity rate similar to other replicative DNAPs generally
used to amplify DNA.
In spite of its high fidelity, the B35DNAP is able to replicate a template with abasic sites. To do this, this
enzyme inserts, preferably, an adenine opposite the damage and resume replication without generating a
frameshift. Moreover, deletion of the TPR2 subdomain, required for processivity, impairs primer extension
beyond the abasic site.
On the other hand, the functional and biochemical characterization of the protein encoded by the ORF4 of
the Bam35 genome, showed that this protein acts as a primer during the DNA replication. The B35DNAP uses
the third nucleotide at the 3´ end of the DNA as the template to catalyse the formation of the phosphoester
bound of the complementary nucleotide to an OH group of the tyrosine 194 residue of the TP. Subsequently,
the initiation complex can translocate backward through a single-nucleotide jumping-back mechanism to
recover the genetic information of the genome ends.
Finally, the information obtained from the high-throughput analysis between the interactions of all the
proteins codified by the Bam35 genome allows us to propose the P17 protein as the minor capsid protein of
Bam35 and P24 as the penton protein. Besides, the P26 inner membrane hydrolytic protein could have an
important structural function due to its interactions both with other inner membrane proteins and penton
and special vertex proteins. Finally, in the rest of the observed interactions there are 10 more proteins with
yet an unknown function.
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