Optimización del sistema replicativo del bacteriófago ϕ29 para aplicaciones biotecnológicas
Author
Gella Montero, PabloEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)Date
2016-06-17Funded by
Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC/UAM) bajo la dirección de la Doctora Margarita Salas Falgueras y el Doctor Mario Mencía Caballero. Para su realización se contó con una beca predoctoral de la Junta para la Ampliación de Estudios (JAE) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)Subjects
Bacteriófagos - Genética - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-06-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Hace años nuestro laboratorio describió un sistema mínimo para la amplificación eficiente in vitro del
genoma del bacteriófago ϕ29 basado en 4 proteínas codificadas por el propio virus: la DNA polimerasa, la proteína
terminal (TP), la proteína de unión a DNA de banda simple (p5) y la proteína de unión a DNA de banda
doble (p6). Sin embargo, hasta el momento no se había desarrollado un sistema similar para la producción de
DNAs heterólogos unidos a una TP. En la presente tesis doctoral se ha adaptado el sistema de amplificación cebado
por TP a DNAs que no tienen una TP unida inicialmente a sus extremos 5’. Esto se ha realizado mediante
el diseño de distintos abordajes que permiten flanquear los DNAs a amplificar con las secuencias terminales del
genoma de ϕ29, y se ha demostrado la posibilidad de obtener con ellos una amplificación eficiente in vitro cuyo
producto es un DNA heterólogo unido covalentemente a una TP en cada uno de sus extremos 5’.
Con el fin de comprender los eventos tempranos y para encontrar orígenes de replicación mejorados
para la amplificación cebada por TP, en la presente tesis doctoral se ha realizado un estudio sistemático de
diferentes secuencias y estructuras terminales en orígenes artificiales de dsDNA. Se observó que la eficiencia
del origen estaba determinada por una combinación de factores, entre ellos la secuencia y el desapareamiento
de la doble banda y, además, era necesario el reconocimiento de una estructura tipo ‘origen’ (dsDNA y romo).
El origen más eficiente obtenido (30 veces la actividad wild-type) tenía la secuencia CCC en el extremo 3’ de
la hebra molde, AAA en el extremo 5’ de la hebra desplazada y los 6 primeros pares de bases desapareados. El
incremento en la actividad de los orígenes mejorados parecía ser el resultado de la reducción de una barrera
termodinámica en la etapa de transición.
Trabajos anteriores han demostrado que el dominio N-terminal de la TP presenta capacidad de unión a
DNA de forma inespecífica de secuencia. En la presente tesis doctoral se propuso generar una unión específica
como forma de mejorar el acceso de la maquinaria de replicación al origen y, por lo tanto, la eficiencia de
replicación. Para ello, se sustituyó el dominio N-terminal de la TP por el dominio de unión a DNA del factor
de transcripción GAL4 y se generó una diana de reconocimiento para GAL4 haciendo los mínimos cambios
posibles en un origen basado en la secuencia del extremo derecho de ϕ29. Sin embargo, la proteína no resultó
funcional, habiendo perdido la capacidad de unión a DNA.
La unión del genoma de ϕ29 a la TP, codificada por él mismo, hace del sistema del bacteriófago ϕ29
una plataforma muy interesante para fusionar nuevas funciones a un DNA y desarrollar aplicaciones tipo DNA
display. En la presente tesis doctoral, se ha empleado la transposición al azar de GFP en la secuencia de la TP
con el objeto de encontrar sitios potenciales de inserción seleccionando 12 proteínas que fueron analizadas con
el sistema replicativo de ϕ29. De éstas, una permite una inserción de hasta 17 aminoácidos en su secuencia,
manteniendo la funcionalidad de la proteína, y puede ser la base de nuevas tecnologías que aún están en proceso
de desarrollo, concretamente para la transferencia de genes Some years ago our laboratory described a minimal system for the in vitro efficient amplification
of the genome of bacteriophage ϕ29. This minimal system is based in 4 phage-encoded proteins: DNA
polymerase (p2), Terminal Protein (TP), single-stranded DNA binding protein (p5) and double-stranded
DNA binding protein (p6). Until now, this amplification system has not been developed to produce
defined TP-linked heterologous DNAs in a fashion similar to the amplification of the phage ϕ29 genome.
In the present work we adapt this system to DNAs lacking a TP in their 5’ ends. For that, we have
designed different approaches that allow the flanking of these ends with the terminal sequences of the
genome of ϕ29, demonstrating the possibility of obtaining an in vitro efficient amplification whose
product is an heterologous DNA covalently linked to a TP at both 5’ ends.
To understand the early replication events and find improved replication origins for the TPprimed
amplification, we systematically analyzed different sequences and terminal structures in dsDNA
artificial origins. We observed that origin efficiency depends on several factors like the sequence and the
double strand unpairing, and also that a structurally recognizable origin was needed (dsDNA and blunt).
The strongest origin (30-fold wild-type activity) had the sequence CCC at the 3’ end, AAA at the 5’ end
and its 6 first base pairs unpaired. The increased activity of the origins seemed to be the result of the
reduction of a thermodynamic barrier at the transition step.
Previous works have shown that the TP N-terminal domain possesses non-specific DNA
binding capacity in vitro. In this work, we proposed generating a specific DNA binding to improve the
access of the replication machinery to the origin and, therefore, the replication efficiency. For this, we
replaced the TP N-terminal domain with the DNA binding domain of the GAL4 transcription factor. We
also generated the recognition target for GAL4 on an origin based in the right ϕ29 DNA end sequence
making the minimum number of changes possible. However, the protein was not functional, having lost
the DNA binding ability.
The linkage of the ϕ29 genome to the TP, encoded by itself, makes the bacteriophage ϕ29
system an interesting platform to fuse new functions to a DNA or to develop applications such as DNA
display. In this work, we used the random GFP transposition into the TP sequence to find potencial
insertion sites. We selected 12 proteins that were analyzed with the replicative system of ϕ29. One of
these proteins has proved to be active even with a 17 amino acid insertion, and it could be the basis for
new technologies that are still under development, namely gene transfer
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