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Resumen de Toxicidad de los cultivos de cianobacterias. Determinación de cianotoxinas y mecanismos de acción tóxica

María Victoria Ríos Camacho

  • Las investigaciones sobre floraciones tóxicas o potencialmente tóxicas de cianobacterias, en concreto productoras de microcistinas (MCs) y cilindrospermopsina (CYN), pueden abarcar muy diversos campos de estudio. La presencia de estas toxinas en las aguas de ríos y estanques de todo el mundo se ha convertido en un importante problema en materia de contaminación ambiental, sanitaria y económica, ya que pueden afectar a la calidad de las aguas destinadas a la pesca, acuicultura y agricultura, así como a la salud de los animales y seres humanos. Se ha demostrado que la exposición humana a éstas puede ocurrir durante la realización de actividades recreativas en lagos contaminados con las toxinas, o tras la ingesta de alimentos contaminados, bien a través de alimentos vegetales que han sido regados con aguas tóxicas o por el consumo de pescado u otros organismos acuáticos capturados en aguas contaminadas con MCs o CYN.

    El género Microcystis es uno de los dominantes del fitoplancton en los lagos eutróficos y el más común en las aguas dulces, siendo la especie M. aeruginosa la más conocida por ser la principal productora de MCs. Sin embargo, los escasos estudios existentes sobre la cinética de producción de MCs muestran diferencias entre las distintas cepas de esta misma especie. Por ello consideramos de gran importancia, la realización de nuevos estudios que ayuden a dilucidar la forma en la que diferentes factores influyen en el crecimiento de distintas cepas de M. aeruginosa, así como su dinámica de crecimiento y producción de toxinas.

    Para llevar a cabo la evaluación de los riesgos medioambientales y de la salud que suponen la presencia de MCs y CYN en aguas contaminadas, es importante la puesta a punto de métodos analíticos para su detección. Se han desarrollado varias técnicas analíticas para la identificación y cuantificación tanto de MCs como CYN, destacando la Cromatografía Líquida de Alta Resolución unida a un detector de masas triple caudrupolo (LC-MS). Existen otras técnicas alternativas como la Pirólisis, utilizada previamente por nuestro equipo para la detección de MCs, que podrían ponerse a punto para la determinación de CYN, lo que supondría un ahorro de tiempo y recursos, disminuyendo además las posibles pérdidas del analito debido a que no requiere de extracción previa.

    Por otro lado, se ha demostrado la capacidad que tienen las MCs de bioacumularse en distintos órganos de animales acuáticos (peces y cangrejos de río) que son habitualmente destinados al consumo humano, suponiendo un gran riesgo para la salud pública. En este sentido, es necesario el control de estas toxinas en organismos acuáticos de ríos, estanques y lagos de agua dulce para poder realizar una evaluación más precisa del riesgo real para el consumidor.

    Por último, a diferencia de lo que ocurre con las MCs, los estudios in vivo sobre el papel que juega el estrés oxidativo en el mecanismo de toxicidad de CYN son escasos. Nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo varios estudios in vivo que confirman el papel que juega la CYN en la inducción de estrés oxidativo en peces expuestos de forma aguda o subcrónica tras una única administración de CYN por diferentes vías. Sería de gran interés estudiar este mecanismo de acción tóxica bajo condiciones de administración a dosis repetidas, por diferentes vías de exposición, así como la posible reversión de los efectos tóxicos producidos por CYN tras diferentes períodos de depuración.

    Es por ello que se decidió realizar una serie de estudios, tanto a escala de laboratorio como de campo, que nos permitieran conocer en mayor medida, por un lado la cinética de producción de las MCs en distintas cepas de M. aeruginosa, la principal especie productora de MCs, así como la incidencia de esta especie en aguas del suroeste de España y su transferencia a los principales animales acuáticos destinados al consumo humano en dicha región. Con respecto a la CYN, se han llevado a cabo estudios para profundizar en el mecanismo de acción tóxica de la CYN sobre las especies acuáticas que pueden verse más afectadas por esta toxina en la naturaleza y su detección mediante técnicas analíticas alternativas.

    ESTUDIOS SOBRE LAS MCs La cepa M. aeruginosa PCC7806, productora de MCs, ha sido objeto de diversos estudios con el propósito de poner de manifiesto cómo algunos parámetros pueden afectar a la producción de MCs, la topología y toxicidad de esta cepa, utilizando para la detección de estas toxinas diferentes técnicas analíticas, tales como LC-DAD, ELISA y ensayo de la PP2A. Sin embargo, no hay información disponible sobre la cinética de producción de MCs por esta cepa determinada por LC-MS. Por otro lado, aunque existen estudios realizados sobre la cinética de producción de MCs por M. aeruginosa PCC7820, no se han realizado hasta el momento de forma comparativa en relación a otra cepa productora, ni por varias técnicas analíticas al mismo tiempo. Por todo ello, se procedió a realizar un estudio a escala de laboratorio sobre la producción cinética de MCs intracelulares por estas dos cepas a lo largo del tiempo, con el fin de comparar su dinámica de crecimiento y producción de MCs por diferentes técnicas analíticas: LC-MS, ELISA anti-Adda y ensayo de inhibición de la PP2A.

    Los resultados obtenidos mostraron dinámicas de crecimiento diferentes entre las cepas, siendo el crecimiento de PCC7806 mayor que la de PCC7820 (1,7 veces) y alcanzándose la fase estacionaria tras 21 y 12 días de cultivo, respectivamente. Resultados similares a los nuestros fueron obtenidos por otros grupos de investigación. Sevilla y col. (2010) observaron una concentración celular máxima de ¿4x 107 cels/mL a los 15 días de cultivo en la cepa PCC7806, coincidiendo con la obtenida por nosotros en ese mismo período de tiempo (4x 107 cels/mL). Del mismo modo, Robillot y col. (2000) observaron que la cepa PCC7820 alcanzó la fase estacionaria a los 12 días de cultivo al igual que en nuestro estudio.

    Con respecto a los parámetros utilizados para el seguimiento del crecimiento de los cultivos (número de células, producción de clorofila a y densidad óptica) mostraron una buena correlación en la cepa PCC7806. De forma similar; varios autores también observaron una sincronización entre la cuantificación celular y los niveles de clorofila a en esta cepa (Downing y col., 2005; Wang y col., 2010), incrementándose ambos parámetros en el tiempo, hecho observado del mismo modo por Wu y col. (2009). En la cepa PCC7820 sólo se observó esta correlación entre la producción de clorofila a y la densidad óptica. Diferencias en el crecimiento de distintas cepas de una misma especie podrían influir en la no correlación de estos parámetros en PCC7820.

    Así mismo, la concentración de MCs totales producida por la cepa PCC7820 fue mayor que la producida por PCC7806 (3 veces). Esta diferencia en la producción de MCs entre cepas de una misma especie se ha podido comprobar por otros autores en cultivos realizados a escala de laboratorio en distintas especies como M. aeruginosa (Ohtake y col., 1989; Rivasseau y col., 1998) y Anabaena sp. (Rapala y col., 1998). Se confirma de nuevo que la producción de MCs es variable, no sólo entre distintas especies, sino entre cepas diferentes de una misma especie.

    En cuanto al contenido de MCs intracelulares, la mayor producción se alcanzó al comienzo de la fase exponencial de crecimiento de ambas cepas. Robillot y col. (2000) estudiaron la cinética de producción de PCC7820 observando este máximo a los 7 días, al igual que nosotros. Además, los contenidos de MCs intracelulares detectado por las distintas técnicas empleadas (ELISA anti-Adda, ensayo de la PP2A y LC-MS) durante el tiempo de cultivo, mostraron una misma tendencia en la cepa PCC7820, mientras que en la cepa PCC7806 sólo se observó correlación entre el ensayo de inhibición de la PP2A y LC-MS. En ambas cepas los niveles de MCs calculados por ELISA anti-Adda fueron mayores que los detectados por las otras dos técnicas. Resultados similares fueron obtenidos por otros grupos de investigación en los que se emplearon diferentes muestras de cultivos. Lawrence y col. (2001) observaron que la concentración de MCs en productos de cianobacterias determinada por LC-MS/MS fue significativamente menor que tras ensayos bioquímicos. Del mismo modo, Rapala y col. (2002) compararon la idoneidad de ELISA y LC-UV para detectar diferentes variantes tóxicas usando varias matrices (toxinas puras, cultivos realizados a escala de laboratorio y aguas contaminadas con cianobacterias tóxicas), resultando los valores por LC más bajos que los ELISA, al igual que Moreno y col. (2005) que detectaron una sobreestimación de MCs en floraciones naturales por ELISA en comparación con LC-UV. Por último, Tillmanns y col. (2007) obtuvieron resultados mayores por ELISA que los obtenidos por LC-DAD en floraciones de cianobacterias presentes en aguas naturales.

    Con respecto a las variantes de MCs detectadas, en la cepa PCC7806 fueron MC-LR, MC-LR desmetilada (D-Asp3-MCLR) y una variante de MC-LR con una serina metilada (MeSer) en la posición 7 ([L-MeSer7] MC-LR). Las dos primeras fueron identificadas en esta cepa en estudios previos sobre el impacto de ciertos parámetros en la producción de MCs (Downing y col., 2005; Jähnichen y col., 2007; Sevilla y col., 2010), en el que la MC-LR fue la más abundante, coincidiendo con nuestros resultados. La tercera de las toxinas, [L-MeSer7] MC-LR ha sido detectada en esta cepa por primera vez. Su identificación ha sido posible ya que del Campo y Ouahid (2010) la detectaron en la cepa de M. aeruginosa UAM 1303. En cuanto a la cepa PCC7820 se identificaron seis MCs diferentes: MC-LR, D-Asp3-MCLR, Dglu(OCH3)-MCLR, MC-LY, MC-LW y MC-LF, siendo MC-LR la más abundante. El perfil de MCs identificadas en esta cepa también fue objeto de estudio por otros autores, siendo los resultados obtenidos similares aunque no idénticos. En este sentido, Lawton y col. (1994) detectaron MC-LR como la más abundante, sin embargo, también detectaron MC-LM, no identificada en el presente estudio, mientras que no observaron la presencia de D-Asp3-MCLR. Del mismo modo, Bateman y col. (1995) observaron MC-LR como toxina predominante, identificando otras seis MCs más, algunas de las cuales no se han detectado en este estudio. Así mismo, Robillot y col. (2000) observaron la presencia de tres nuevas variantes, no detectadas por nosotros. No obstante, la discrepancia entre estos perfiles de MCs podría ser debida a los diferentes métodos utilizados para la extracción, purificación y determinación de MCs por LC-MS, así como a las condiciones de cultivo (del Campo y Ouahid, 2010).

    En relación a la producción de MCs en floraciones de cianobacterias presentes en aguas naturales como son aguas de ríos, estanques y lagos, estas toxinas coexisten con diferentes organismos acuáticos pudiendo acumularse en los mismos y siendo muchos de ellos destinados al consumo humano. Sin embargo, debido a la gran complejidad y variabilidad que conlleva la realización de estudios de campo frente a los de laboratorio, son escasas las investigaciones realizadas en España que relacionen los niveles de MCs detectados y su presencia en estos organismos acuáticos. Por este motivo, se procedió en primer lugar a monitorizar la presencia de floraciones de cianobacterias potencialmente tóxicas en aguas naturales de charcas tenqueras de Cáceres y posteriormente a identificar y cuantificar distintas MCs en los animales acuáticos naturalmente expuestos a estas floraciones y que son consumidos a través de la pesca por la población de esta zona.

    La monitorización llevada a cabo en las charcas tenqueras confirmó la presencia de especies de cianobacterias tóxicas del género Microcystis, Aphanizomenon y Anabaena, hecho observado por nuestro equipo en un estudio previo realizado en la misma zona (Moreno y col., 2011). Las MCs detectadas en las muestras de agua fueron MC-LR, MC-RR y MC-YR, y la concentración de MCs totales fue similar a la observada previamente por nuestro equipo, con valores entre 3,8 y 6,5 ¿g/L (Moreno y col., 2011). Además, en la mayoría de las muestras monitorizadas en las charcas tenqueras de Barruecos de Abajo, y en algunas de Lugar y Albufera, las concentraciones de MCs detectadas superaban el límite recomendado por la OMS para el agua potable (1 ¿g MC-LR/L).

    En cuanto a la posible acumulación de MCs en los órganos de los organismos acuáticos recolectados en estas charcas tenqueras, nuestros resultados mostraron la presencia de MCs sólo en las muestras de cangrejo, P. clarkii, predominando MC-LR (7,5 ¿g/g) frente a MC-RR (2,2 ¿g/g), no detectándose la presencia de MC-YR. Resultados similares fueron obtenidos por Chen y Xie (2005a, b) que detectaron 8,03 ¿g MC-LR/g y 5,44 ¿g MC-RR/g en P. clarkii recolectados en aguas continentales chinas. Sin embargo, Tricarico y col. (2008) detectaron valores mucho menores (0,4 ng MCs/g) en esta misma especie en aguas italianos. Por otro lado, no se detectaron MCs en el hígado y músculo de las tencas recolectadas, pudiendo deberse a que las concentraciones de MCs en estos peces son dependientes, en gran medida, de la exposición a corto, medio o largo plazo y por tanto, impredecibles (Kankaanpaa y col., 2002). Además, existen diferencias interespecies que podrían influenciar una distinta acumulación de estas toxinas en los diferentes organismos acuáticos expuestos en las mismas condiciones.

    Los resultados observados en el estudio de campo confirman que M. aeruginosa es la cianobacteria productora de MCs más frecuentemente detectada y que MC-LR es la toxina más abundante. No obstante, se ha podido comprobar a escala de laboratorio, que la producción de MCs es variable, dependiendo su cinética de producción tanto de la especie como de la cepa productora y de las condiciones del medio. Además, su acumulación en organismos acuáticos muestra mayor susceptibilidad y mayor capacidad de acumulación de MCs de unas especies frente a otras, lo que debe tenerse en cuenta en estudios de evaluación del riesgo tóxico que puede suponer la ingesta de especies contaminadas por la población humana. Los resultados de estos experimentos dieron lugar a las siguientes publicaciones: COMPARISON OF MICROCYSTIS AERUGINOSA (PCC7820 AND PCC7806) GROWTH AND INTRACELLULAR MICROCYSTINS CONTENT DETERMINED BY LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY, ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ANTI-ADDA AND PHOSPHATASE BIOASSAY (Ríos y col., 2014. Journal of Water and Health 12, 69-80) ANALYSIS OF MC-LR AND MC-RR IN TISSUE FROM FRESHWATER FISH (TINCA TINCA) AND CRAYFISH (PROCAMBARUS CLARKII) IN TENCH PONDS (CÁCERES, SPAIN) BY LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY (LC-MS) (Ríos y col., 2013. Food and Chemical Toxicology 57, 170-178) ESTUDIOS SOBRE CYN Debido a que CYN es una toxina emergente, su mecanismo de acción tóxica en las distintas especies acuáticas es menos conocido que el de las MCs. Las cianotoxinas pueden acumularse en peces a través de diferentes vías: por ingesta directa del fitoplancton, por captación de la cianotoxina disuelta a través del epitelio (branquias, piel), o a través de la cadena alimentaria. Generalmente se cree que la vía oral es la más importante (Ernst y col., 2001) y la acumulación de cianotoxinas suele depender del tiempo de exposición (Vasconcelos, 1995; Sipiä y col., 2002; Ozawa y col., 2003). Además, es probable que exista una relación directa entre la acumulación de CYN y la peligrosidad de sus efectos tóxicos. Por esto, nos propusimos estudiar el efecto de diversas variables experimentales como vía de administración (inmersión/oral), la forma de administración (biomasa de A. ovalisporum o células liofilizadas del mismo cultivo) y el tiempo de exposición (7, 14 y 21 días) sobre la alteración de biomarcadores de estrés oxidativo en hígado y riñón de peces de consumo humano (O. niloticus) expuestos a dosis repetidas de CYN.

    Se observó un aumento de LPO en hígado y riñón mostrándose mayores alteraciones en los peces expuestos a la biomasa de A. ovalisporum por inmersión durante 21 días. De forma similar, Puerto y col. (2011) demostraron que la LPO aumentó de manera dosis-dependiente en hígado y riñón de tilapias expuestos a CYN pura por sonda de forma aguda a 200 y 400 ¿g CYN/kg de peso corporal. Por el contrario, Gutiérrez-Praena y col. (2011b) observaron un aumento significativo en este parámetro sin detectar diferencias significativas entre distintas vías (sonda o inyección intraperitoneal) y tiempos de exposición (24 horas y a los 5 días) en hígado y riñón de tilapias por exposición aguda a 200 ¿g CYN pura/kg. No obstante, estos autores compararon tiempos menores de exposición que los nuestros e investigaron con CYN pura mientras que nuestro ensayo fue realizado con células de cianobacterias que además de CYN incluyen compuestos bioactivos (Hawkins y col., 1997; Norris y col., 1999) que podrían propiciar la asimilación de la toxina mejor por una vía que por otra. Guzmán-Guillén y col. (2013a), en tilapias expuestas por inmersión a la biomasa de A. ovalisporum (10 y 100 ¿g CYN/L) de forma subcrónica (7 y 14 días), mostraron que la LPO aumentó significativamente en el hígado de los peces tratados con ambas dosis sólo para un período de exposición de 14 días, mientras que en el riñón este parámetro aumentó significativamente en los peces tratados con la dosis más alta de CYN después de ambos períodos.

    La oxidación de proteínas se mostró más elevada en los hígados de peces expuestos a CYN por inmersión durante 7 días; sin embargo en el riñón este aumento se observó por vía oral durante 21 días, confirmándose la influencia de la vía y el tiempo de exposición en ambos órganos. De acuerdo con estos resultados, Guzmán-Guillén y col. (2013a) mostraron un aumento significativo de este parámetro en hígado y riñón de tilapias expuestas por inmersión a células de A. ovalisporum (100 ¿g CYN/L) durante 14 días demostrando la influencia de la concentración de CYN y del tiempo de exposición. Por otra parte, otros autores señalan al riñón como el órgano más afectado en este parámetro en peces expuestos de forma aguda a CYN pura (Puerto y col., 2011). Asimismo, otros estudios mostraron que la vía de exposición (sonda nasogástrica o inyección i.p.) influye sobre este biomarcador en el riñón de peces expuestos de forma aguda a 200 ¿g CYN pura/kg y sacrificados a las 24 horas y a los 5 días (Gutiérrez-Praena y col., 2011b).

    La oxidación de ADN se observa en el riñón de forma más temprana que en hígado (7 días de exposición frente a 14 días) poniendo de manifiesto la mayor susceptibilidad del riñón, evidenciada por mayores alteraciones en otros parámetros y comentada por otros autores (Guzmán-Guillén y col., 2013a).

    Debido a que GST cataliza la conjugación de GSH con centros electrofílicos de gran variedad de sustratos, ayudando a destoxicar compuestos endógenos como los lípidos peroxidados (Leaver y George, 1998) y a eliminar xenobióticos, las diferencias significativas en la disminución de la actividad GST en hígado y riñón de peces expuestos a la biomasa y a las células liofilizadas observadas frente al tiempo (21 días frente a 14 y 7 días), podrían indicar que el mecanismo de destoxicación de lípidos peroxidados, proteínas y ADN oxidados no se estaría llevando a cabo por la ruta de conjugación con GSH o, por otra parte, que la actividad enzimática GST no está implicada en el metabolismo de CYN. Por el contrario, Puerto y col. (2011) observaron un aumento en la actividad de esta enzima en ambos órganos de tilapia expuestas a 200 ¿g CYN pura/kg, sugiriendo que el efecto inhibidor de la síntesis de GST necesite un tiempo mayor de 24 h para ser observado in vivo.

    Por otra parte, el aumento de los productos de peroxidación lipídica en ambos órganos con el tiempo concuerda con el incremento en la actividad GPx en el hígado (después de 7 días) y en el riñón (a lo largo de los tres períodos de exposición) de los peces expuestos a CYN mediante biomasa y células liofilizadas de A. ovalisporum. La función de GPx es reducir los hidroperóxidos lipídicos a sus correspondientes alcoholes, y el peróxido de hidrógeno a agua, por lo que su aumento a lo largo de los tres períodos de exposición en el riñón, confirma la mayor sensibilidad de este órgano tras largos períodos de exposición. De forma similar, en el presente estudio se demuestra una mayor sensibilidad del riñón frente al hígado observada mediante la disminución en la actividad SOD durante los tres períodos estudiados. Esto podría explicarse por una destrucción enzimática de SOD en riñón, mientras que en el hígado que es un órgano con mayor capacidad de destoxicación se ve aumentada. De esta forma, el mayor aumento en la actividad SOD en hígado tras la exposición por vía oral a células liofilizadas frente a la inmersión en biomasa podría explicar los menores niveles de LPO, oxidación de proteínas y ADN observados.

    En ambos órganos estudiados, la actividad CAT muestra diferentes respuestas a lo largo del tiempo. No obstante, tanto CAT como GPx actúan intentando eliminar el exceso de H2O2 y parecen estar más activas, tratando de controlar los radicales de oxígeno, tras 7 días de exposición a CYN.

    A pesar de que investigaciones llevadas a cabo por Norris y col. (2002) en ratón consideraban al citocromo P450 fundamental en la patogenicidad de CYN, sugiriendo que era poco probable que el agotamiento de GSH (por conjugación con CYN o por inhibición de su síntesis) fuera el principal mecanismo de toxicidad hepática, el aumento en la actividad ¿-GCS (enzima limitante en la síntesis de GSH) junto con el agotamiento de GSH/GSSG observado tanto en hígado como en riñón por ambas vías estudiadas, señalan la reducción de GSH como mecanismo predominante en la eliminación de ERO. Además, ¿-GCS se vio influenciado por el tiempo (21 y 14 días frente a 7 días) y la vía de exposición (inmersión comparada con vía oral) en el hígado de los peces expuestos a CYN. De acuerdo con estos resultados, Guzmán-Guillén y col. (2013a), observaron un aumento en la actividad de esta enzima, principalmente en el riñón de tilapias expuestas de forma subcrónica a CYN durante 7 y 14 días. Por el contrario, Gutiérrez-Praena y col. (2011b) observan una reducción significativa en la actividad de la enzima ¿-GCS en tilapias expuestas de forma aguda a CYN por vía oral o inyección i.p., sacrificadas a las 24 horas, aunque no hubo cambios significativos en los peces sacrificados a los 5 días. Esto indicaría que una única dosis más alta de CYN pura administrada puede dañar las enzimas, mientras que dosis más bajas de células de cianobacterias (equivalente a 10 ó 100 ¿g CYN/L), administradas por un período de tiempo más largo, pueden inducir una respuesta defensiva (Guzmán-Guillén y col., 2013a). Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: ALTERACIÓN DE BIOMARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO EN PESCADO DE CONSUMO PÚBLICO (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPUESTO A DOSIS REPETIDAS DE CILINDROSPERMOPSINA POR DIFERENTES VÍAS DE ADMINISTRACIÓN (Ríos y col., 2014. Aceptado por Revista de Toxicología) Una vez confirmada la influencia de diferentes variables de exposición en la alteración de biomarcadores de estrés oxidativo en hígado y riñón de peces expuestos a CYN, nos interesó estudiar la posible reversión de estos efectos tóxicos tras dos períodos de depuración. Basándonos en el estudio anterior se escogieron aquellas variables de exposición a CYN que mostraron mayor influencia en los parámetros de estrés oxidativo en peces, la vía de inmersión y la biomasa del cultivo. Así mismo los peces fueron expuestos a dosis repetidas cada 2 días de 10 ¿g CYN/L mediante inmersión en cultivo de A. ovalisporum durante 14 días, tras los cuales se pasaron a acuarios libres de CYN para ser depurados durante dos períodos antes de su sacrificio (3 o 7 días).

    Al igual que en el estudio anterior se observa un aumento significativo de la actividad GPx en riñón tras 14 días de exposición, mientras que no se muestra alteración de la misma en el hígado. Con el objeto de profundizar en la influencia de la CYN sobre la expresión génica de esta enzima, se realizaron estudios a nivel molecular observándose en ambos órganos (hígado y riñón) un aumento en la expresión génica de GPx tras 14 días de exposición a CYN, que puede ser interpretado como una mayor sensibilidad de los biomarcadores moleculares. De forma similar, otros autores no observaron cambios en la actividad GPx en el hígado y sí en su expresión génica, además las concentraciones de CYN y tiempos de exposición fueron diferentes (Puerto y col., 2011; Gutiérrez-Praena y col., 2013b). Otros estudios han demostrado la producción de niveles altos de LPO inducida por CYN en estos peces (Guzmán-Guillén y col., 2014), por lo que la inducción de la expresión génica de GPx podría indicar una respuesta defensiva de los peces frente a la agresión tóxica de estos productos.

    En cuanto a los efectos en los períodos de depuración considerados, en hígado no se mostró ninguna influencia en la actividad GPx. De forma similar, Galanti y col. (2013) no observaron cambios en la actividad GPx ni en el periodo de exposición (3 días), ni en el período de desintoxicación (6 días) en camarones (Palaemonetes argentinus) expuestos a MC-LR en condiciones de laboratorio. Por el contrario, Ferreira y col. (2007) encontraron una disminución significativa de la actividad GPx en el hígado de salmonetes expuestos a contaminantes en el estuario del Duero después de un mes de depuración. La alteración de GPx observada en el riñón tras la exposición a CYN se recuperó después de 3 días de depuración. Nuestros resultados concuerdan con la reducción de la de LPO observada en estos peces y la recuperación en sólo 3 días del balance GSH/GSSG durante el proceso de depuración de CYN (Guzmán-Guillén y col., 2014). Para observar la recuperación de la inducción de la expresión genética de GPx inducida por CYN en el hígado, fue necesario un periodo de depuración de 7 días. Sin embargo, en el riñón este periodo no fue suficiente, manifestando de nuevo una mayor susceptibilidad de este órgano en comparación con el hígado.

    El patrón similar de la actividad GPx y de su expresión génica en el hígado y la no coincidencia con otros estudios de exposición y depuración, podría sugerir una regulación post-transcripcional de la enzima o un efecto combinado de diferentes genes GPx, como las variadas isoformas de GPx que se encuentran en vertebrados (Vernet y col., 1999; Wang y col., 2006).

    En cuanto a la actividad GST se observa una disminución significativa en ambos órganos tras 14 días de exposición, coincidiendo con los resultados del estudio anterior. Sin embargo, tras realizar estudios de esta enzima a nivel molecular, la expresión génica de GST siguió patrones diferentes con respecto a su actividad observándose un aumento de su expresión genética sólo en riñón tras 14 días de exposición a CYN. Resultados similares fueron obtenidos por este mismo grupo aunque las concentraciones de CYN y el tiempo de exposición fueron diferentes (Puerto y col., 2011; Gutiérrez-Praena y col., 2013b). Las respuestas en hígado y riñón pueden ser diferentes debido a que la transcripción de las isoformas de GST varía de distinta manera dentro de un órgano y entre órganos, como dedujo Li y col. (2008) tras realizar un estudio de peces expuestos a MC-LR. Además, la existencia de distintas isoformas de GST puede explicar las diferencias observadas entre la actividad enzimática y la expresión genética. Por el contrario, la abundancia relativa de GST sólo disminuyó en hígado tras 14 días de exposición. Aunque esta disminución puede estar relacionada con la inhibición de la síntesis de proteínas producida por CYN como uno de sus mecanismos de acción tóxica (Terao y col., 1994; Runnegar y col., 1995), estos resultados son contradictorios a los obtenidos por Puerto y col. (2001) y Gutiérrez-Praena y col. (2013b) en los que se emplearon una única dosis de CYN pura y un período de exposición más corto. La abundancia relativa de GST no se correlacionó en todos los casos con la actividad y la expresión genética de la enzima, lo que sugiere que existe una regulación a nivel transcripcional y traduccional o modificaciones postraduccionales.

    Durante el período de depuración, la actividad GST se recuperó en ambos órganos tras 7 días de depuración. Estos resultados podrían estar relacionados con la restauración de los niveles de GSH/GSSG durante el proceso de depuración observado por Guzmán-Guillén y col. (2014), ya que la actividad de esta enzima depende de un suministro constante de GSH. De igual manera, otros autores detectaron también un incremento de la actividad GST en esta y otras especies acuáticas tras un período de depuración (Özcan Oruç, 2010; Galanti y col., 2013).

    Del mismo modo, la expresión génica de GST se vio aumentada en ambos órganos tras ambos períodos de depuración, mientras que la abundancia relativa de GST recuperó los valores control en hígado tras 3 días de depuración, ya que en el riñón este parámetro no se afectó durante el período de exposición.

    La reversibilidad de los efectos de estrés oxidativo inducidos por CYN tras someter a los peces a distintos períodos de depuración, ya había sido observada previamente con otros contaminantes (Freitas y col., 2012; Galanti y col., 2013). Estos estudios sugieren que el tiempo necesario para detectar la influencia del proceso de depuración es diferente para cada contaminante, y depende entre otros factores de la intensidad de la exposición tóxica, los mecanismos de desintoxicación disponibles, la cinética de eliminación de la sustancia tóxica y el biomarcador investigado. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: INFLUENCE OF TWO DEPURATION PERIODS ON THE ACTIVITY AND TRANSCRIPTION OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN TILAPIA EXPOSED TO REPEATED DOSES OF CYLINDROSPERMOPSIN UNDER LABORATORY CONDITIONS (Ríos y col., 2014. Toxins 6, 1062-1079) Por todo esto, y al igual que ocurre con las MCs, la monitorización de CYN en aguas contaminadas por cianobacterias es de gran importancia para evaluar los riesgos que supone su exposición para la salud y el medioambiente. Las técnicas analíticas empleadas para detectar y cuantificar CYN, tanto en aguas como en otras matrices, son similares a las utilizadas para MCs (ELISA, LC-DAD, LC-MS y LC-MS/MS). Sin embargo, como ya se ha comentado anteriormente, estos métodos requieren, en la mayoría de los casos, una extracción previa y una instrumentación relativamente sofisticada. Por ello, nos propusimos evaluar la idoneidad de técnicas de pirólisis como herramienta potencial para un análisis rápido de CYN, ya que se había observado previamente su idoneidad para la detección de MCs (Cameán y col., 2005). Para ello, se estudió el comportamiento pirolítico de un estándar puro de CYN y tres cultivos de cianobacterias liofilizados: dos cultivos de A. ovalisporum productora de CYN (CYN+) y un cultivo de C. raciborskii no productora de CYN (CYN-) mediante pirólisis analítica convencional (Py-GC/MS) a 500ºC y termoquimiolisis en presencia de TMAH (TCh-GC/MS) a 280ºC, utilizando además para esta última técnica una muestra del liofilizado de C. raciborskii (CYN-) adicionada con CYN pura.

    Los cromatogramas obtenidos en el análisis por Py-GC/MS mostraron dos picos característicos a un tiempo de retención >20 minutos en el fragmento iónico m/z 194 y visible a tiempo de retención 25,0 y 28,9 min, sólo en las muestras que contienen CYN. Este fragmento con masa molecular m/z 194 fue utilizado anteriormente por Eaglesham y col. (1999) como valor diagnóstico para la detección de CYN en aguas superficiales mediante LC-MS/MS. Por otro lado, los cromatogramas obtenidos en el análisis por TCh-GC/MS mostraron los tres primeros picos después del minuto 14 correspondientes a ácidos grasos metilados (palmítico, esteárico y ácido oleico no saturado). Autores como Ahlgren y col. (1992) observaron que estos ácidos grasos son abundantes en las microalgas de agua dulce, y por tanto podría considerarse como valor diagnóstico para la detección de cianobacterias. Además, en nuestro análisis se observó también un pico de un compuesto desconocido presente solamente en las muestras que contienen CYN, incluida la muestra CYN- adicionada con CYN pura. Este compuesto característico con masa molecular m/z 336 y visible a 22,23 min podría corresponderse con el fragmento resultante de la pérdida del SO3 de la molécula de CYN y por tanto, tener valor diagnóstico para detectar esta toxina en floraciones de cianobacterias.

    En función de los resultados obtenidos se sugiere la necesidad de realizar nuevos estudios dirigidos a la optimización de esta técnica empleando muestras reales como método de screening para la detección de CYN, ya que supondría un ahorro de tiempo y recursos, disminuyendo además las posibles pérdidas del analito debido a que no requiere de extracción previa. Estos resultados han dado lugar a la siguiente publicación: DETECTION OF CYLINDROSPERMOPSIN TOXIN MARKERS IN CYANOBACTERIAL ALGAL BLOOMS USING ANALYTICAL PYROLYSIS (PY-GC/MS) AND THERMALLY-ASSISTED HYDROLYSIS AND METHYLATION (TCH-GC/MS) (Ríos y col., 2014. Chemosphere. In Press, Corrected Proof)


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