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Implementación de la vitrificación embrionaria en las razas equinas como herramienta para su conservación y progreso

  • Autores: Guillermo Vizuete Calero
  • Directores de la Tesis: Carlos Carmelo Pérez Marín (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2016
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Lydia Gil Huerta (presid.), Estrella I. Agüera (secret.), Graça Ferreira-Dias (voc.)
  • Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias y Ciencias Agroalimentarias por la Universidad de Córdoba
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: Helvia
  • Resumen
    • RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D. GUILLERMO VIZUETE CALERO El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:

      1. Introducción o motivación de la tesis La industria equina es un sector que posee una gran importancia dentro la economía y la sociedad a nivel mundial, donde ciertas razas de nuestra zona gozan de un especial significado a nivel socio-cultural. Por ello es un sector en el que debemos aumentar la conservación, producción y desarrollo de su especie.

      Tradicionalmente las principales medidas de actuación que se han llevado a cabo por parte de dicha industria pasaban por la gestión de sementales y compra-venta de yeguas a ganaderos; en la actualidad, y gracias a los avances en el campo de investigación, contamos con multitud de Técnicas de Reproducción Asistida, como la sincronización de celos, extracción de semen, inseminación artificial, transferencia de embriones o la criopreservación de germoplasma y embriones, entre otras. Todas ellas poseen una gran importancia hoy día, aunque en el caso de los équidos su eficiencia se encuentran muy por detrás de otras especies de producción.

      En las últimas décadas, la transferencia de embriones ha adquirido una gran notoriedad en el sector, consiguiendo que la genética materna llegue a comercializarse de manera similar al semen de los sementales. Sin embargo, los resultados obtenidos en la criopreservación de embriones equinos no son del todo satisfactorios, debido a las características anatómicas y fisiológicas propias de la especie equina. El avance en esta técnica y, por tanto, la mejora de los resultados, supondría una serie de ventajas en el sector: por un lado, se produciría un mayor número de crías al año de la yegua y/o semental deseados; por otro, sería posible el nacimiento de potros cuyas madres poseen problemas que le imposibilitan el parto o yeguas que se encuentren compitiendo, sin la necesidad de tener que dejar de ampliar su palmarés; además, se facilitaría la comercialización internacional de material genético, sin tener que transportar animales para ello, solo embriones, etc.

      2. Contenido de la investigación La finalidad de la presente Tesis Doctoral ha sido proponer alternativas a la conservación y desarrollo de ciertas razas equinas en peligro de extinción, implementando la vitrificación como método de criopreservación que simplifica y abarata los costes de dicho proceso.

      Con tal fin se han evaluado los diferentes aspectos a desarrollar en un programa de transferencia de embriones, haciendo mayor hincapié en la inducción y sincronización del celo de las yeguas, con objeto de mejorar y optimizar el proceso. Para ello se ha desarrollado un programa de criopreservación en dos especies en peligro de extinción, el caballo hispano-árabe y el asno, andaluz y zamorano-leones.

      El trabajo llevado a cabo consta de cuatro estudios experimentales en un total de 125 animales: En el primer estudio, se han sometido 42 yeguas a diferentes protocolos de inducción y sincronización de celo, todas ellas en estado de anestro estacional, con folículos de un diámetro inferior a 20mm, ausencia de cuerpo lúteo y unos niveles de progesterona inferiores a 1ng/ml. El grupo control consta de 15 animales sometidos a un seguimiento ecográfico y estudio de plasma sanguíneo. El resto se distribuyen en 3 grupos de diferentes tratamientos: T1 administración oral de altrenogest (0.044mg/kg; Regumate®, Esteve) durante 11 días; T2 aplicación de un dispositivo intravaginal de progesterona (1.38g; CIDR®) durante 11 días; y T3 aplicación del mismo dispositivo intravaginal de progesterona (1.38g; CIDR®) durante solo 8 días. Todas las yeguas incluidas en este estudio recibieron 1 ml intramuscular de DL-Cloprostenol (Dalmazin®, Fatro-Ibérica) un día después de terminar el tratamiento. Durante esos días, se realizó un estudio ecográfico diario para observar el crecimiento folicular y el día de ovulación de dichos animales, además de extracciones diarias de sangre antes del tratamiento y hasta el final del mismo para conocer los niveles de progesterona y de leptina en el plasma durante todo el proceso.

      El uso de tratamientos con progestágenos es ampliamente utilizado en la literatura científica, siendo el más habitual el uso de la vía oral. En el caso que nos ocupa, ninguno de los tratamientos intravaginales provocó endometritis clínicas que pudieran afectar a la fertilidad de la yegua (Handler y col., 2006; Newcombe y Wilson, 1997) y ningún dispositivo se perdió, por lo que, desde el punto de vista práctico, los dispositivos intravaginales se erigen como una alternativa eficaz debido a su facilidad y homogeneidad en la dosis y la aplicación de tratamiento. Como resultado, un total de 88,5% de las yeguas recuperaron la ciclicidad tras el tratamiento, ninguna ovuló durante el tratamiento RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D. GUILLERMO VIZUETE CALERO El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:

      3. Introducción o motivación de la tesis La industria equina es un sector que posee una gran importancia dentro la economía y la sociedad a nivel mundial, donde ciertas razas de nuestra zona gozan de un especial significado a nivel socio-cultural. Por ello es un sector en el que debemos aumentar la conservación, producción y desarrollo de su especie.

      Tradicionalmente las principales medidas de actuación que se han llevado a cabo por parte de dicha industria pasaban por la gestión de sementales y compra-venta de yeguas a ganaderos; en la actualidad, y gracias a los avances en el campo de investigación, contamos con multitud de Técnicas de Reproducción Asistida, como la sincronización de celos, extracción de semen, inseminación artificial, transferencia de embriones o la criopreservación de germoplasma y embriones, entre otras. Todas ellas poseen una gran importancia hoy día, aunque en el caso de los équidos su eficiencia se encuentran muy por detrás de otras especies de producción.

      En las últimas décadas, la transferencia de embriones ha adquirido una gran notoriedad en el sector, consiguiendo que la genética materna llegue a comercializarse de manera similar al semen de los sementales. Sin embargo, los resultados obtenidos en la criopreservación de embriones equinos no son del todo satisfactorios, debido a las características anatómicas y fisiológicas propias de la especie equina. El avance en esta técnica y, por tanto, la mejora de los resultados, supondría una serie de ventajas en el sector: por un lado, se produciría un mayor número de crías al año de la yegua y/o semental deseados; por otro, sería posible el nacimiento de potros cuyas madres poseen problemas que le imposibilitan el parto o yeguas que se encuentren compitiendo, sin la necesidad de tener que dejar de ampliar su palmarés; además, se facilitaría la comercialización internacional de material genético, sin tener que transportar animales para ello, solo embriones, etc.

      4. Contenido de la investigación La finalidad de la presente Tesis Doctoral ha sido proponer alternativas a la conservación y desarrollo de ciertas razas equinas en peligro de extinción, implementando la vitrificación como método de criopreservación que simplifica y abarata los costes de dicho proceso.

      Con tal fin se han evaluado los diferentes aspectos a desarrollar en un programa de transferencia de embriones, haciendo mayor hincapié en la inducción y sincronización del celo de las yeguas, con objeto de mejorar y optimizar el proceso. Para ello se ha desarrollado un programa de criopreservación en dos especies en peligro de extinción, el caballo hispano-árabe y el asno, andaluz y zamorano-leones.

      El trabajo llevado a cabo consta de cuatro estudios experimentales en un total de 125 animales: En el primer estudio, se han sometido 42 yeguas a diferentes protocolos de inducción y sincronización de celo, todas ellas en estado de anestro estacional, con folículos de un diámetro inferior a 20mm, ausencia de cuerpo lúteo y unos niveles de progesterona inferiores a 1ng/ml. El grupo control consta de 15 animales sometidos a un seguimiento ecográfico y estudio de plasma sanguíneo. El resto se distribuyen en 3 grupos de diferentes tratamientos: T1 administración oral de altrenogest (0.044mg/kg; Regumate®, Esteve) durante 11 días; T2 aplicación de un dispositivo intravaginal de progesterona (1.38g; CIDR®) durante 11 días; y T3 aplicación del mismo dispositivo intravaginal de progesterona (1.38g; CIDR®) durante solo 8 días. Todas las yeguas incluidas en este estudio recibieron 1 ml intramuscular de DL-Cloprostenol (Dalmazin®, Fatro-Ibérica) un día después de terminar el tratamiento. Durante esos días, se realizó un estudio ecográfico diario para observar el crecimiento folicular y el día de ovulación de dichos animales, además de extracciones diarias de sangre antes del tratamiento y hasta el final del mismo para conocer los niveles de progesterona y de leptina en el plasma durante todo el proceso.

      El uso de tratamientos con progestágenos es ampliamente utilizado en la literatura científica, siendo el más habitual el uso de la vía oral. En el caso que nos ocupa, ninguno de los tratamientos intravaginales provocó endometritis clínicas que pudieran afectar a la fertilidad de la yegua (Handler y col., 2006; Newcombe y Wilson, 1997) y ningún dispositivo se perdió, por lo que, desde el punto de vista práctico, los dispositivos intravaginales se erigen como una alternativa eficaz debido a su facilidad y homogeneidad en la dosis y la aplicación de tratamiento. Como resultado, un total de 88,5% de las yeguas recuperaron la ciclicidad tras el tratamiento, ninguna ovuló durante el tratamiento !!br0ken!! a diferencia de los resultados obtenidos por otros autores (Newcombe, 2002; Handler y col., 2006), y el porcentaje de yeguas en celo y la tasa de ovulación fueron similares en los diferentes grupos descritos.

      Asimismo, la tasa de gestación a la primera ovulación es más baja que la observada por otros autores, aunque no se observaron diferencias significativas respecto a las de nuestro grupo control (Cuervo-Arango & Clark 2010; Hanlon y Firth, 2012). Las dosis empleadas en nuestro estudio fueron más bajas que las usadas en otros, por lo que se demuestra que dosis más baja y un tiempo de aplicación menor (8 días en lugar de 11) no afectan a la inducción del celo.

      Sin embargo, hayamos diferencias significativas en los niveles de leptina entre las yeguas que respondieron al tratamiento y las que no, obteniendo una mayor concentración de leptina las que sí respondieron, por lo que se podría emplear como indicador de eficacia en los tratamientos de inducción de celo.

      El segundo de los trabajos realizados es un estudio retrospectivo del programa de conservación de embriones en las especies anteriores. En este caso, se emplearon 61 yeguas donantes y 13 sementales en caballos, y 17 burras donantes y 5 garañones en asnos. El estudio se centró en la tasa de recogida por lavado y por ovulación, y la influencia de los principales factores que afectan a dicho proceso. En él se observaron diferencias significativas en la tasa de ovulación entre las especies, siendo mucho mayor en burra que en yegua. Sin embargo, la tasa de ovulación individual no se ve afectada por la estacionalidad.

      La tasa de recogida mostró una diferencia significativa en función de la estacionalidad, siendo mayor en época reproductiva que fuera de ella (Koblischke y col., 2008); esta tasa también aumenta en función de la tasa de ovulación (Squire y col., 1999; Stout, 2006; McCue y col., 2010), sin embargo no se ve afectada ni por la edad de la donante, ni el día de lavado, ni la calidad del lavado.

      La tasa de ovulación no se ve afectada por la edad ni por la estación reproductiva aunque otros autores observaron lo contrario (Pérez-Marín y col., 2016), el estudio tuvo una tasa de recogida baja, aunque similar a la de otros autores que empleaban semen refrigerado como (Oberstein y col., 2001; Baranska y col., 2012).

      En cuanto a la calidad, el 90% de los embriones eran de calidad excelente o buena y la gran variabilidad en las tallas y morfologías se puede explicar por la asincronía de las ovulaciones múltiples.

      En el tercer estudio pretendió conocer el ambiente uterino de la donante en el momento del flushing y estudiar si existe alguna relación con la existencia de embrión. Para ello se han empleado dos grupos: un grupo control formado por 8 yeguas con endometritis clínica en el que se realiza una toma de muestra para citología y cultivo mediante hisopo y se compara con el líquido restante en el filtro de embriones tras realizar un lavado (tal y como se realiza para recoger embriones) realizando citología y cultivo de ese líquido del filtro. Un segundo grupo de 20 yeguas a las que se les realiza el lavado de embriones y la muestra para citología y cultivo se obtiene del líquido que queda en el filtro.

      En el grupo control los resultados obtenidos de la comparación fueron prácticamente idénticos en los dos métodos realizados. En el otro grupo no hubo ninguna yegua con un cultivo y citología fueran positivas a ambas pruebas (circunstancia que se considera necesaria para diagnosticar endometritis en la yegua), lo cual, evidencian el buen estado del útero de las donantes, además las especies aisladas en el útero se encuentran en muy bajo número y con ausencia de células inflamatorias (Leblanc y col., 2007) El cuarto estudio pretende comparar de forma in vitro de diferentes protocolos de vitrificación de embriones equinos. Para ello se utilizan 14 embriones de caballo hispano-árabe y 12 embriones de burro (Andaluz y Zamorano leones) y se distribuyen en 3 grupos diferentes. En los embriones de caballo 5 se congelan de forma convencional a 1,5M de etilenglicol en pajuela de 0,25 ml y con un criocongelador. Otros 5 se utilizan para vitrificarlos según el método comercial con una concentración final de 3.6M de glicerol mas 4.6M de etilenglicol en pajuela de 0.25 ml y otros 5 embriones se vitrifican con la misma concentración que el anterior pero en un dispositivo denominado “fibreplug” y utilizando un bloque de vitrificación en superficie solida. En el caso de los embriones de burro 4 se congelan de forma convencional en 1.5M de etilenglicol en pajuela de 0.25 ml con criocongelador, 4 se vitrifican en fibreplug en bloque de vitrificación a la concentración de los embriones de caballo y otros 4 se vitrifican en el mismo soporte pero a una concentración final de 7M de etilenglicol.

      El estudio in vitro se realiza mediante tinciones de DAPI, TUNEL y Faloidina, para comprobar el daño sufrido por cada proceso y se estudia mediante microscopia confocal.

      Se observa una pérdida de calidad morfológica entre los diferentes grupos tras el proceso de criopreservacion.

      Los porcentajes de muerte celular es mayor en los vitrificados que en los congelados pero nuestros resultados son mejores para ambos procesos que los de otros autores Oberstein y col., 2001; Moussa y col., 2005; Tharasanit y col., 2005; Hendriks & Stout, 2010.

      Los embriones de caballo vitrificados tuvieron mayor porcentaje de células apoptóticas que los congelados y algo mayores que otros estudios Pomar y col., (2005); Baranska y col., (2014), sin embargo los embriones de asno tuvieron un índice de apoptosis bajo sobretodo los del grupo 3.

      En cuanto al citoesqueleto no se observaron diferencias entre los grupo y ninguno de los embriones tuvo un citoesqueleto de la peor calidad.

      5. Conclusión De todo lo anteriormente expuesto, deducimos las siguientes conclusiones: Primera. Los tratamientos con dispositivos intravaginales de progesterona son una buena alternativa a los tratamientos orales en yeguas. Estos permiten disminuir los días de tratamiento, facilitan el manejo de los animales e impiden la pérdida innecesaria de dosis, en comparación con los orales. Además son una herramienta fundamental en programas de criopreservación de embriones, permitiendo adelantar y aumentar el número de ciclos al año en la donante.

      Segunda. La leptina es un buen indicador de la eficacia de éxito de estos programas de inducción de celo en las yeguas.

      Tercera. Los resultados obtenidos en el programa de conservación de embriones de équidos en peligro de extinción están afectados por la estacionalidad y el número de ovulaciones en yeguas, mientras que en asnos se ven afectados por la tasa de ovulación. La calidad embrionaria no parece verse afectada por ninguno de los parámetros estudiados, y sí el tamaño de los embriones, el cual depende tanto del día recogida como de su estatus morfológico. Los resultados en la tasa de recogida se pueden explicar por el bajo número de animales de los que disponemos y la imposibilidad de seleccionar a los mejores para su uso, además de tener que realizar la mayor parte del trabajo en época reproductiva desfavorable.

      Cuarta. El análisis del efluente retenido en el filtro después de la colección de embriones es un método eficiente para evaluar el estatus bacteriológico y citológico del útero de las donantes.

      Quinta. Los embriones equinos son más susceptibles a la vitrificación que a la congelación convencional, aunque estos nuevos protocolos de vitrificación muestran mejores resultados in vitro que protocolos de vitrificación anteriores que, sumado a los beneficios de la vitrificación (mas rápido, sencillo y barato), aumentan las esperanzas de seguir investigando en el proceso de vitrificación de embriones equinos.


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