Cation-mediated interaction between dna and anionic lipid surfaces: experimental and simulation study
- Autores: Germán Luque Caballero
- Directores de la Tesis: Alberto Martín Molina (dir. tes.), Victor Manuel Quesada Perez (dir. tes.), Julia Maldonado Valderrama (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Ángel Cabrerizo Vílchez (presid.), Ana Belén Jódar Reyes (secret.), Alberto Antonio Caria Canelas Pais (voc.), Elena Junquera González (voc.), M. Carmen Morán Badenas (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
RESUMEN El objeto de este estudio es la interacción entre polianiones y membranas cargadas negativamente mediada por cationes multivalentes. Este fenómeno se pone de manifiesto en la formación de lipoplejos aniónicos, que son agregados mesoscópicos formados a partir de liposomas con carga negativa y polinucleótidos en presencia de cationes multivalentes. El interés en este tipo de sistemas se debe a su capacidad para transportar material genético al interior celular, permitiendo el acceso a una diana terapéutica a nivel molecular. Su principal ventaja frente a otro tipo de vectores usados en terapia génica es que, al estar formados por lípidos presentes en la membrana celular, su toxicidad es mucho menor. La investigación básica que nos planteamos con este proyecto sobre la naturaleza de las interacciones presentes en los lipoplejos aniónicos es esencial para comprender los mecanismos responsables de su formación, estabilidad y función. Así, en el presente trabajo realizamos una caracterización del sistema membrana-catión-polianión combinando enfoques experimentales y teóricos.
El manuscrito comienza con una introducción donde se resume el estado del arte de la biofísica de lipoplejos aniónicos. En primer lugar, se recopilan los resultados relacionados con la estructura y función de una variedad de sistemas preparados en disolución. Seguidamente, presentamos el estudio de la complejación en la interfase aire-agua como un modelo experimental para indagar en la influencia de otros factores como el empaquetamiento lateral. Finalmente, describimos la aplicación de modelos teóricos para predecir los factores que gobiernan la formación y la estructura de este tipo de complejos. Más adelante, planteamos los objetivos del proyecto de investigación de acuerdo a los enfoques mencionados en la introducción.
En la sección de metodología, detallamos los protocolos experimentales y de simulación empleados. En particular, la deposición de películas por el método de Langmuir-Blodgett y la visualización por microscopía de fuerzas atómicas de las estructuras presentes en la interfase se ha puesto a punto en nuestro laboratorio. Las medidas de espectroscopía de reflexión-absorción de infrarrojo se realizaron durante una estancia de formación en el Instituto Max Planck de Coloides e Interfases en Potsdam (Alemania). También se ha desarrollado el código fuente de los programas utilizados para llevar a cabo las simulaciones computacionales sobre modelos de grano grueso. Las medidas de espectroscopía de fluorescencia se realizaron a través de una colaboración en los laboratorios del Departamento de Química-Física de la Universidad de Granada.
A continuación, discutimos ampliamente los resultados obtenidos, y las publicaciones a las que han dado lugar se recogen en un anexo. La presentación de los resultados se organiza en función de la estrategia utilizada para estudiar la complejación. Primero, presentamos los resultados procedentes de la caracterización de la interacción en la interfase aire-disolución, visualizando las estructuras resultantes e identificando los grupos funcionales implicados; después, evaluamos la capacidad de encapsulamiento de ADN en disolución y por último, mostramos los resultados del estudio teórico sobre el papel de las interacciones electrostáticas en la formación y estabilidad de los complejos.
Finalmente, enunciamos las conclusiones en función de los resultados del trabajo. Así, hemos demostrado que interacciones de distinta naturaleza concurren en la formación de los lipoplejos aniónicos. En particular, los efectos superficiales derivados del empaquetamiento lateral modulan la morfología de las estructuras que se forman en la interfase, mientras que las interacciones electrostáticas afectan de manera decisiva a la estabilidad de los complejos. Tras valorar el trabajo realizado, consideramos que a partir del conocimiento adquirido en esta investigación es necesaria una caracterización más amplia, profundizando en los enfoques escogidos en combinación con otras estrategias, permitiendo desentrañar el conjunto de interacciones que intervienen en estos sistemas complejos. La comprensión de aspectos básicos de la formación, estabilidad y función de los lipoplejos aniónicos será de gran ayuda para el diseño de fórmulas optimizadas para prestaciones biomédicas.
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ABSTRACT The object of this survey is the interaction between polyanions and negatively charged membranes as mediated by multivalent cations. This phenomenon appears in the formation of anionic lipoplexes, which are mesoscopic assemblies formed from negatively charged liposomes and polynucleotides in the presence of multivalent cations. The interest in this sort of systems is due to its capability to transport genetic material inside the cell, allowing access to a therapeutic target at a molecular level. Their main advantage over other kinds of vectors used in gene therapy is that, since they are formed by lipids occurring in the cell membrane, their toxicity is much lower. The basic research we address in this project about the nature of the interactions involved in anionic lipoplexes is essential to understand the mechanisms underlying their formation, stability and function. Thus, in the present work we carry out a characterization of the membrane-cation-polyanion system through a combination of experimental and theoretical approaches.
The manuscript begins with an introduction where we summarize the state of the art of the biophysics of anionic lipoplexes. Firstly, we list the results about the structure and function of a variety of systems prepared in solution. Next, we introduce the study of complexation at the air-water interface as an experimental model to look into the influence of other factors such as lateral packing. Finally, we describe the application of theoretical models to predict the factors governing the formation and structure of this kind of complexes. Later on, we formulate the aims of this research project in agreement with the approaches mentioned in the introduction.
In the methodology section, we detail the experimental and simulation protocols used. In particular, we have set up the Langmuir-Blodgett technique for film deposition and atomic force microscopy imaging of the structures at the interface, in our laboratory. We have performed infrared reflexion-absorption spectroscopy measurements during a short training stay in the Max Planck Institute for Colloids and Interfaces in Potsdam (Germany). We have also programmed the source code used in coarse grain simulations. We have carried out fluorescence spectroscopy measurements through a collaboration in the Physical Chemistry Department in the University of Granada.
Afterward, we thoroughly discuss the results obtained and the publications to which they have given rise are listed in the annex. We have organized result presentation from the strategy employed to study the complexation. First, we show the results obtained from the characterization of the interaction at the air-solution interface, visualizing the resulting structures and identifying the functional groups involved; then, we evaluate DNA encapsulation capability in solution and, in the end, we show the results concerning the theoretical study of the role of electrostatic interactions in complex formation and stability.
Finally, we enunciate the conclusions based on the results of this work. In this way, we have learned that interactions of different nature combine to form anionic lipoplexes. Especially, surface effects derived from the lateral packing modulate the morphology of the structures formed at the interface, while electrostatic interactions affect in a decisive way to complex stability. After assessment of the work done, we consider that, based on the knowledge gained in this research we begin to understand the mechanisms involved in DNA/anionic lipid complexation. However,it is necessary to improve the approaches chosen here in combination with other strategies, in order to elucidate the group of interactions that take place in these complex systems. Only by understanding the fundamentals of formation, stability and function of anionic lipoplexes, we may be able to rationally design optimized formulations for a biomedical performance.
Bibliografía / References (1) Martín-Molina A.; Luque-Caballero G.; Faraudo J.; Quesada-Pérez M.; Maldonado-Valderrama J. Adsorption of DNA onto Anionic Lipid Surfaces. Adv Colloid Interface Sci. 2014, 206, 172-175.
(2) Luque-Caballero G.; Martin-Molina A.; Sanchez-Trevino A.Y.; Rodriguez-Valverde M.A.; Cabrerizo-Vilchez M.A.; Maldonado-Valderrama J. Using AFM to Probe the Complexation of DNA with Anionic Lipids Mediated by Ca2+: the Role of Surface Pressure. Soft Matter. 2014, 10, 2805-2815.
(3) Luque-Caballero G.; Martin-Molina A.; Quesada-Perez M. Polyelectrolyte Adsorption onto Like-Charged Surfaces Mediated by Trivalent Counterions: a Monte Carlo Simulation Study. J Chem Phys. 2014, 140, 174701.
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