Resumen de Estudio de superficies texturizadas desde topografía micrométrica a nanométrica para aplicaciones bioadhesivas
This thesis was mainly focused on the analysis of the role played by the surface roughness of structured biomaterial surfaces, from micro- to nano-scale topography, through a complete set of mathematical tools, from classic statistical to advanced ones. Acid etching of titanium surfaces was studied in detail because of its wide use in the field of implantology. Finally, osteoblast-like cells response was studied on modified silicon and engineered titanium surfaces in collaboration with odontological and medical research groups.
The main questions that this work addressed are: how should surface roughness be characterized and what mathematical tools should be used for it in the case of surfaces with biomedical applications? how is acid etching of titanium surfaces described through Minkowski functionals and scaling analysis? and, finally, how does surface roughness affect the osteoblast-like cell adhesion on modified silicon and engineered titanium surfaces? This dissertation involves different aspects of surface physics related to the surface characterization, particularly the roughness characterization for the optimization of textured surfaces in biomaterial engineering. Thus, beyond the known statistical roughness, we have conducted a more complete characterization of the roughness of real surfaces.
First of all, we studied how the roughness factor (surface area ratio) measurement is altered by the topography acquisition and, particularly the role played by scan-size, topography resolution or triangular tessellation algorithms. Furthermore, from the analysis of a wide set of numerical surfaces simulated with a fractional Brownian noise, we studied how the roughness factor values are affected by waviness filtering due to the directionality effect on the addition of waviness and roughness in real surfaces. Thus, the main conclusions of this part of the thesis can be summarized as follows: • In increasing order of loss of information, the parameters that affect the roughness factor are: the tessellation algorithms used to mesh the topography, the scan-size employed to acquire the topography, and the resolution of the topography (number of points collected by the topography). This order of importance of the parameters studied seems to be regardless of the instrument used to acquire the topography.
• Filtering processes used to isolate different surface features of a topography according to their wavelengths, specifically roughness and waviness, involve the loss of part of the surface topography information. This loss could lead to under/overestimate roughness parameters according to the direction followed to add the roughness to the waviness in the (pre-filtered) morphology. For any wavy rough surface, it is not possible to know in detail what roughening process governed its origin and evolution. Therefore, the superposition (addition) of waviness and roughness in the real surface could have happened in any direction. So, the experimental roughness factor disagrees to the actual, but experimentally inaccessible, value of roughness factor. Nevertheless, it is possible to find an estimate. This thesis proposes an alternative based on the weighting of the surface area ratio for the raw topography data (considering waviness and roughness) by the surface associated to the waviness. Thereby, if we do not know the process that determined the surface morphology, our method reduces the error associated to the estimation of surface roughness by using the surface area ratio.
Secondly, we analyzed the morphology produced by HF acid etching on commercially pure titanium surfaces using integral geometry and stochastic analysis. Minkowski functionals (integral geometry tools) revealed information about the percolation threshold on acid-etched titanium surfaces and its change with etching time. On the other hand, stochastic analysis suggested that acid-etched surfaces of commercially pure titanium exhibit both intrinsic anomalous scaling and multiscaling regardless of etching time. Moreover, a crossover was also observed for etching times close to 3 min due to the “poisoning” of the acid-etched surface by titanium hydrides (T iH). This crossover was also found in the roughness factor for acid-etched titanium surfaces. These results points out to that a deeper characterization of surface roughness is suitable for those applications where nanoscale features play a crucial role in growth and proliferation of cells on implant surfaces. The main conclusions of this part of the thesis can be summarized as follows: • From the integral geometry analysis we conclude that the use of Minkowski functionals is highly recommended. This set of mathematical tools allowed to classify the acid-etched of commercially pure titanium surfaces in terms of percolation networks. The etching time could be an optimizing parameter on the evolution of acid-etched titanium surfaces and, therefore, for the quality of these implant surfaces. The percolation threshold for acid-etched surfaces shown a maximum for etching times close to 3 min. Therefore, as a high percolation threshold points out to better fluid retention properties, biological fluids should penetrate better the rough exposed surface and consequently, the osteoblast-like cells response should be enhanced for acid-etched titanium when etching time is close to 3 min.
• Kinetic roughening of HF acid-etched commercially pure titanium surfaces, as growth process driven by anisotropic rules, obeyed rules of anomalous scaling. Surface evolution is mediated by surface chemistry and corrosion resistance of the surface due to the existence of a varying-thickness thin film of T iO2 . Also, regardless of etching time, acid-etched titanium surfaces exhibited both multiscaling and intrinsic anomalous scaling. Moreover, for etching times close to 3 min, the behavior of the surface changes drastically due to its poisoning. Scaling analysis might be helpful to explain the effect of surface features of implant topography on the cell growth and, to elucidate the complex mechanisms occurring at the implant surface in contact with the surrounding biological tissues. Thus, scaling analysis could serve as a link between biomaterial engineering and statistical physics. As a general recommendation, for acid etching of real surfaces, it is necessary to consider the time elapsed from the beginning of etching for identifying the roughening regime and if there is any transition between regimes.
• The maximum value of roughness factor of acid-etched titanium in terms of etching time may reveal a dynamic transition due to the competition between heterogeneous erosion and homogeneous normal-directed erosion. The transition between these two types of roughening processes might be modulated by both the oxidation state of the surface and the formation of etch-stop species just below it; poisoning due to the presence of T iO2 and TiH2 on the surface. The acid concentration, the etching rate (produced by laminar or turbulent flow), the initial roughness and the grain orientation of the untreated titanium surface will also regulate at some extent the time for which the surface area of acid-etched surfaces is maximized. In terms of erosion and surface curvature, the roughness factor maximum is also interpreted as the crossover between two regimes: an initial regime where the surface is mainly composed of peaks and the (normal-directed) etching promotes the sharpening of peaks increasing surface area), although with decreasing heights each time, until a second regimen where the valleys dominate (further by grain detachment) whereas they are flattened by normal etching (decreasing surface area).
• This transition between roughening regimes is also observed with advancing/receding contact angle measurements and preliminary experiments of osteoblast-like cell adhesion on acid-etched titanium surfaces. Moreover, a similar behavior was also observed on acid-etched glass surfaces.
Finally, we conducted MG-63 osteoblast-cell cultures (adhesion, proliferation and morphology) on silicon (with different physical and chemical properties) and titanium surfaces (modified withdifferent surface treatments). For silicon surfaces, the correlation between the wettability produced by methylation (on smooth surfaces) and nanoroughness (on unmethylated surfaces) produced by NaOH basic etching and the response of osteoblast-like cells was analyzed. It was possible to conclude that an increase of nanoroughness or water contact angle enhanced osteoblast behavior in terms of cell morphology, proliferation and immunophenotype. The effect caused by the methylation is more significant than the effect caused by the nanoroughness. For titanium surfaces, the effect of different texturization methods (blastering, acid etching and the combination of both) on cell adhesion and proliferation was studied. The different physicochemical treatments used to modify the surface properties of commercially pure titanium surfaces point out to that both surface chemistry and roughness affect the osteoblast-like cell response but, for surfaces with similar surface chemistry, cell adhesion and proliferation are mainly driven by roughness. From the characterization of the surface topographies in terms of fractal dimension, it was possible to assure that the surface structure generated by acid etching enhances cell adhesion and proliferation.
As nanoroughness induced by acid etching on titanium surfaces improves the cell adhesion and proliferation, surface roughness should be precisely characterized by using parameters such as fractal dimension and other tools described in this thesis.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Esta tesis se ha centrado, principalmente, en el análisis de la rugosidad superficial de superficies texturizas de biomateriales, desde escala micro- a nanoscópica, mediante el uso de una extensa batería de herramientas matemáticas, desde las herramientas estadísticas clásicas hasta las más avanzadas. Además, dado su amplio uso en el campo de la implantología, el grabado ácido de las superficies de titanio fue estudiado en detalle. Finalmente, en colaboración con grupos de investigación en medicina y odontología, se realizaron estudios sobre la respuesta celular de células osteoblásticas sobre superficies modificadas de silicio y titanio.
Las principales cuestiones que este trabajo respondió fueron: ?`cómo debe ser caracterizada la rugosidad superficial y qué herramientas matemáticas debemos emplear para ello en el caso de superficies con aplicaciones biomédicas? ?`cómo describen los funcionales de Minkowski y el análisis de escalado el grabado ácido de las superficies de titanio? y, por último, ?`cómo afecta la rugosidad superficial a la adhesión celular de osteoblastos sobre superficies modificadas de silicio y titanio? Esta tesis aborda diferentes aspectos de la física de superficies relacionados con la caracterización superficial, particularmente, la caracterización de la rugosidad para la optimización de superficies texturizadas en ingeniería de materiales. Así, hemos realizado una caracterización completa de la rugosidad de superficies reales, más allá de la mera caracterización estadística.
En primer lugar, se estudió en qué modo se ven afectadas las medidas del factor de rugosidad (fracción de área superficial) por el método de adquisición de la topografía superficial y, en particular, el papel que juega el tamaño de la región escaneada, la resolución y el algoritmo de teselación triangular en la medida del factor de rugosidad. Además, a partir del análisis de un vasto conjunto de superficies simuladas numéricamente, mediante un algoritmo de movimiento Browniano fraccional, se estudió en qué modo se ven afectados los valores del factor de rugosidad por los procesos de filtrado de la ondulación superficial debido al efecto direccional de la adición de la ondulación y la rugosidad en superficies reales. Así, las principales conclusiones de esta parte de la tesis pueden resumirse del siguiente modo:
• En orden creciente de pérdida de información, los parámetros que afectan a la medida del factor de rugosidad son: el algoritmo de teselación utilizado par mallar la topografía, el tamaño de la región escaneada y la resolución de la topografía (el número de puntos recogidos en la topografía). El orden de importancia de los parámetros estudiados parece ser independiente del instrumento utilizado para adquirir la topografía.
• Los procesos de filtrado utilizados para aislar los rasgos característicos de la topografía de acuerdo con sus longitudes de onda, especialmente la rugosidad y la ondulación, implican la pérdida de parte de la información topográfica. Esta pérdida podría conducir a la subestimación/sobrestimación de los parámetros de rugosidad dependiendo de cual haya sido la dirección seguida al añadir la rugosidad a la ondulación en la morfología prefiltrada. Dado que para cualquier superficie rugosa y ondulada es imposible conocer en detalle qué proceso de arrugado gobernó su origen y evolución, la superposición (adición) de la ondulación y la rugosidad en una superficie real podría suceder en cualquier dirección. Por tanto, el factor de rugosidad experimental difiere del valor real, pero experimentalmente innaccesible, del factor de rugosidad. Sin embargo, es posible encontrar un valor estimado. Esta tesis propone una alternativa basada en el promediado de los datos topográficos en bruto (incluyendo ondulación y rugosidad) por la fracción de área superficial asociada a la ondulación. De este modo, si desconocemos el proceso que determinó la morfología superficial, nuestro método reduce el error asociado a la estimación de la rugosidad superficial mediante el uso de la fracción de área superficial.
En segundo lugar, analizamos la morfología producida por el grabado con ácido fluorhídrico de superficies comercialmente puras de titanio usando geometría integral y análisis estocástico. Los funcionales de Minkowski (herramientas de geometría integral) revelaron información acerca del umbral de percolación para superficies de titanio grabadas con ácido y su dependencia con el tiempo de grabado. Por otro lado, el análisis estocástico sugirió que las superficies de titanio comercialmente puro grabadas con ácido presentan tanto escalado anómalo intrínseco como multiescalado, independientemente del tiempo de grabado. Además, se observó un ``crossover'' para tiempos de grabado cercanos a los tres minutos debido al ``envenenamiento'' por hidruro de titanio de estas superficies. Este ``crossover'' también fue encontrado en el comportamiento del factor de rugosidad medido sobre superficies de titanio grabadas con ácido. Estos resultados apuntan a que es necesario un caracterización más profunda de la rugosidad superficial en aquellas aplicaciones para las que los rasgos superficiales de escala nanométrica jueguen un papel crucial, como es el caso del crecimiento y proliferación celular en las superficies de implantes. Las principales conclusiones de esta parte de la tesis pueden resumirse en: • A partir del análisis mediante geometría integral concluimos que el uso de los funcionales de Minkowski es altamente recomendable. Este conjunto de herramientas matemáticas permitió clasificar el grabado ácido de superficies comercialmente puras de titanio en términos de redes de percolación. El tiempo de grabado podría ser un parámetro válido para optimizar la evolución de las superficies de titanio grabadas con ácido y, por tanto, la calidad de implantes de este tipo de superficies. El umbral de percolación de las superficies grabadas con ácido muestra un máximo para un tiempo de grabado próximo a tres minutos. Por tanto, dado que valores altos del umbral de percolación suponen unas mejores propiedades en cuanto a la retención de fluidos, los fluidos biológicos podrán penetrar mejor en este tipo de superficies rugosas y, por consiguiente, la respuesta celular de osteoblastos debería mejorar para titanio grabado con ácido cuando el tiempo de grabado sea próximo a esos tres minutos.
• El arrugado cinético de superficies de titanio comercialmente puras mediante ácido fluorhídrico, como proceso de crecimiento dirigido por reglas anisótropas, sigue las leyes del escalado anómalo. La evolución superficial está regulada por la química superficial y la resistencia a la corrosión de la superficie debido a la existencia de una capa de espesor variable de dióxido de titanio. También, independientemente del tiempo de grabado, las superficies de titanio grabadas con ácido mostraron arrugado anómalo intrínseco y multiescalado. Además, para tiempos de grabado cercanos a los tres minutos, el comportamiento de la superficie cambió drásticamente debido a su envenenamiento. El análisis de escalado podría ser de ayuda cara a explicar el efecto que tienen los rasgos superficiales de un implante en el crecimiento celular y para esclarecer el complejo mecanismo que sucede en la superficie de un implante en contacto con tejidos biológicos circundantes. Así, el análisis de escalado podría servir como nexo entre la ingeniería de materiales y la física estadística. Como recomendación general, en caso de grabado ácido de superficies reales, es necesario considerar el tiempo transcurrido desde el inicio del grabado para identificar el régimen de arrugado y si existe cualquier tipo de transición entre regímenes.
• El máximo del factor de rugosidad para superficies de titanio grabadas con ácido en función del tiempo de grabado puede revelar una transición dinámica y competitiva entre un proceso erosivo heterogéneo y uno homogéneo según la dirección normal a la superficie. La transición entre estos dos tipos de arrugado puede ser modulada tanto por el estado de oxidación de la superficie como por la formación de especies pasivantes en ella; ``envenenamiento'' debido a la presencia de hidruros de titanio y dióxido de titanio sobre la superficie. La concentración de ácido, la velocidad de grabado (producido por flujo laminar o turbulento), la rugosidad inicial y la orientación de los granos para la superficie de titanio sin grabar también regularán el tiempo de grabado necesario para que el área supercial de la superficies grabadas con ácido alcance un máximo. En términos de erosión y curvatura superficial, el máximo del factor de rugosidad también se interpreta como una transición entre dos regímenes de grabado: un regimen inicial donde la superficie está formada principalmente por picos y en el que el grabado (según la dirección normal) promueve el afilado y la pérdida de altura de esos picos (aumento del área superficial), y un segundo régimen en el que dominan los valles (puede que por el despendimiento de algún grano) a la vez que son aplanados por el grabado ácido en la dirección normal (disminuye el área superficial).
• Esta transición entre regímenes de grabado también fue observada en las medidas de los ángulos de contacto de avance y retroceso y en estudios preliminares de adhesión de osteoblastos en superficies de titanio grabadas con ácido. Además, un comportamiento similar al aquí descrito también fue observado en superficies de vidrio grabadas con ácido.
Por último, se llevaron a cabo cultivos celulares de osteoblastos del tipo MG63 (adhesión, proliferación y morfología) sobre superficies de silicio (con diferentes propiedades físicas y químicas) y titanio (modificadas mediante diferentes tratamientos superficiales). Para la superficies de silicio, se analizó la respuesta celular de los osteoblastos a los cambios de mojabilidad de la superficie (producidos por metilación), y a la nanorugosidad producida por el grabado básico de las superficies mediante hidróxido sódico. Se llegó a la conclusión de que un aumento tanto en la nanorugosidad superficial como en el ángulo de contacto que dicha superficie exhibe ante el agua mejora el comportamiento celular en términos de morfología, proliferación e inmunofenotipo. Los efectos causados por la metilación son más significativos que los producidos por la nanorugosidad. Para la superficies de titanio, se estudio el efecto de diferentes métodos de texturización (``blastering'', grabado ácido y la combinación de ambos) sobre la adhesión y la proliferación celular. Los diferentes tratamientos fisicoquímicos usados para modificar las propiedades superficiales de las superficies de titanio comercialmente puro sugieren que tanto la química como la rugosidad superficial afectan a la respuesta celular aunque, para superficies con similar química superficial, la adhesión y proliferación celular dependen, pricipalmente, de la rugosidad de la superficie. La caracterización, mediante el cálculo de la dimensión fractal, de las superficies generadas por cada método permitió asegurar que las estructuras superficiales generadas por grabado ácido mejoran tanto la adhesión como la proliferación celular.
Dado que la nanorugosidad generada por el grabado ácido de las superficies de titanio mejora la adhesión y proliferación celular, es necesario que su caracterización se haga de un modo más preciso mediante parámetros tales como la dimensión fractal u otros descritos en esta tesis.
Todas estos hallazgos generales relacionados con el cultivo celular pueden ser de gran utilidad para optimizar tanto el diseño de biomateriales como el de las superficies de implantes. Nuestros resultados enfatizan la importancia de los estudios encaminados a esclarecer las relaciones entre el comportamiento celular y las propiedades fisicoquímicas interfaciales y, también, con la necesidad de mejorar la caracterización de la rugosidad superficial más allá del uso de las magnitudes estadísiticas clásicas generalmente empleadas en implantología.
