Efectos de microorganismos rizosféricos autóctonos (bacterias y hongos miorrízico arbusculares) sobre la tolerancia de las plantas al déficit hídrico en zonas semiáridas: mecanismos implicados
- Autores: Elisabeth Armada
- Directores de la Tesis: Rosario Azcón (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Roldán Garrigós (presid.), Antonio Ocaña Cabrera (secret.), Juan Manuel Ruiz Lozano (voc.), María del Carmen Jaizme Vega (voc.), Agustín Probanza Lobo (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
RESUMEN.
Efecto de microorganismos rizosféricos autóctonos (bacterias y hongos micorrízico arbusculares) sobre la tolerancia de las plantas al déficit hídrico en zonas semiáridas: Mecanismos implicados.
Elisabeth Armada Rodríguez Introducción.
Los efectos negativos del cambio climático global aumentarán en los próximos años. Las alteraciones climatológicas afectan el desarrollo de las plantas y tales cambios son especialmente acentuados en zonas caracterizadas por clima semiárido (Denby & Gehring, 2005). El estrés por sequía afecta particularmente a las relaciones hídricas así como, a respuestas fisiológicas más o menos específicas (Beck et al., 2007), causando un efecto perjudicial importante en el crecimiento y la nutrición de la planta. De hecho, la sequía se considera como la causa principal de la disminución de la productividad de las plantas en todo el mundo (Vinocur & Altman, 2005).
En las zonas semiáridas mediterráneas del sureste de España, las escasas e irregulares precipitaciones, y un largo y seco periodo de verano han contribuido drásticamente a la aceleración de los procesos de degradación del suelo. Los cambios originados como consecuencia de la pérdida de las comunidades naturales de plantas vienen precedidos por la degeneración de las propiedades físicas y químicas del suelo, además de por una pérdida o reducción de la actividad microbiana de los mismos.
Se han sugerido varias estrategias para paliar los efectos negativos de la sequía (Warren, 1998). Las estrategias más exploradas han sido el cultivo de variedades tolerantes y el uso de la ingeniería genética. Sin embargo, una estrategia alternativa es inducir la tolerancia al estrés por sequía, mediante el uso de microorganismos beneficiosos como hongos micorrízicos arbusculares (MA) y rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR). Las plantas, en su desarrollo, interactúan con los microorganismos del suelo, y ello puede conducir a que sean más eficientes y tolerantes ante las limitaciones ambientales como la sequía.
El funcionamiento y la estabilidad de los ecosistemas terrestres dependen en gran medida de la diversidad y composición de especies de su cubierta vegetal. Actualmente se acepta que la diversidad y actividad de la microbiota edáfica es la base de uno de los mecanismos que más contribuyen a la conservación del suelo, al desarrollo y mantenimiento de la cubierta vegetal y por consiguiente, a la estabilidad y funcionamiento del ecosistema.
Este trabajo se encuadra dentro de un proyecto que se basa en el estudio de la recuperación de suelos semiáridos y degradados. La zona seleccionada se localiza en el sureste peninsular de España, en el Parque Ecológico (Vicente Blanes), en Molina de Segura, de la provincia de Murcia. Mediante la utilización de microorganismos autóctonos beneficiosos se pretende fomentar la disponibilidad de nutrientes de las plantas y la tolerancia al déficit hídrico.
El objetivo principal de la tesis doctoral es el aislamiento y selección de los microorganismos autóctonos (bacterias y hongos formadores de micorriza arbusculares), que proporcionan beneficio sobre el desarrollo vegetal en dichas zonas desertificadas e incrementar el conocimiento de tal actividad y los mecanismos responsables de la misma.
Para lograr dicho objetivo general se realizaron los siguientes objetivos específicos que se presentan en capítulos sucesivos que conforman este trabajo de investigación orientado a desarrollar biotecnologías que faciliten la recuperación de la cubierta vegetal en zonas semiáridas.
· Aislamiento, selección e identificación de bacterias autóctonos (en base a su actividad promotora del crecimiento vegetal) y estudio del mantenimiento de las mismas en condiciones de estrés hídrico severo y prolongado orientado a su uso como inóculo en plantas autóctonas en condiciones de sequía típica de la zona.
· Determinar el carácter más o menos generalista o específico de la actividad PGPR (plant growth-promoting rhizobacteria) y capacidad de incrementar la tolerancia al estrés hídrico en plantas inoculadas.
· Estudio de los cambios en la biodiversidad microbiana en suelos rizosféricos en diferentes especies vegetales autóctonas tras la inoculación microbiana.
· Aislamiento, identificación y aplicación de los ecotipos autóctonos más abundantes de hongos formadores de micorrización arbuscular, y verificación del efecto de los distintos aislados fúngicos o su mezcla y la interacción con la bacteria autóctona Bacillus thuringiensis. Estudio del cambio en la estructura funcional de la rizosfera provocado por la inoculación.
· Efecto comparativo entre la aplicación de los microorganismos autóctonos beneficiosos seleccionados y el uso de fertilizantes (P y/o K) frente a tolerancia al estrés hídrico en planta autóctona.
· Validar los beneficios del uso de microorganismos autóctonos de un área natural mediterránea degradada, en plantas de importancia agronómica como el maíz. Y estudio de las alteraciones moleculares relacionadas con la expresión de genes acuaporina de maíz.
CAPÍTULO 1.
Caracterización de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal de zonas semiáridas del sureste peninsular de España y la eficacia como inóculos en condiciones de sequía.
El objetivo de este estudio fue el aislamiento, identificación y caracterización de rizobacterias autóctonas predominantes, su capacidad de adaptación a ambientes semiáridos, y la selección basada en las capacidades de promoción de crecimiento en la especie vegetal tanto in vitro como inoculadas en Lactuca sativa crecida bajo condiciones de sequia.
Primeramente, se estudiaron los posibles mecanismos empleados por dichas rizobacterias para sobrevivir en las condiciones de estrés hídrico. Para ello las bacterias se cultivaron en cultivo axénico in vitro con polietilenglicol (PEG) en el medio de cultivo para provocar el estrés osmótico. Además, se evaluaron las capacidades PGPR tales como la solubilización de fosfatos, fijación de nitrógeno, producción de ácido indolacético (AIA), síntesis de ¿-cetobutirato y otras fueron verificadas a dicho nivel de estrés. A su vez, se determinó la posible capacidad endofítica de estas bacterias, tal capacidad es definida como la posibilidad de colonizar los tejidos internos de la planta sin causar infecciones sintomáticas o efectos negativos en su hospedador (Schulz and Boyle, 2006). Concomitantemente, a alto nivel de estrés (40% PEG) fue evaluada la tolerancia bacteriana al estrés osmótico aplicado mediante el análisis de la capacidad bacteriana para la producción de prolina, actividades enzimáticas antioxidantes [ascorbato peroxidasa (APX) y catalasa (CAT)] y la producción de poli-ß-hidroxibutirato (PHB) usados como indicadores. Tras estas evaluaciones destaca Bacillus thuringiensis y Enterobacter sp., como las especies bacterianas más tolerantes al estrés, debido al mantenimiento de un mayor crecimiento ante las condiciones de estrés osmótico aplicadas (40% PEG). La capacidad para tolerar el estrés osmótico celular de dichas especies bacterianas parece estar más asociado a la elevada producción de PHB y/o ACC-deaminasa que a las actividades antioxidantes.
Posteriormente, en un bioensayo en invernadero bajo condiciones de sequía, se evaluó si la inoculación de dichas bacterias autóctonas estimulaba o promovía el crecimiento vegetal, la nutrición, los valores fisiológicos y bioquímicos, y la tolerancia a la sequía de plantas de L. sativa. La inoculación de B. thuringiensis promovió el incremento tanto de la biomasa vegetal como del contenido nutricional (P, K, Ca, Mg, Fe, Mn y Zn) en L. sativa.
Los resultados obtenidos en este estudio nos permite poseer una mejor comprensión y conocimiento para la selección de bacterias de la rizosfera dirigido a una eficaz aplicación con relevancia para mejorar el crecimiento vegetal y por consiguiente, la recuperación de zonas áridas degradadas. La limitación de agua y el estrés osmótico afectan negativamente el desarrollo de las plantas, pero la inoculación bacteriana puede ser capaz de atenuar estos efectos perjudiciales por actuar potenciando en la planta mecanismos moleculares, fisiológicos y bioquímicos relacionados con la tolerancia al estrés hídrico. Este estudio revela que las especies bacterianas autóctonas aisladas, debido a que son cepas bacterianas que están adaptadas a estas condiciones ambientales, fueron tolerantes al estrés osmótico (40% PEG), y que dichos aislados bacterianos que pertenecen mayoritariamente a los géneros Bacillus y Enterobacter, poseen gran resistencia al estrés osmótico.
Desde un punto de vista práctico es importante haber seleccionado bacterias como Bacillus thuringiensis que es la cepa bacteriana autóctona más capacitada para sobrevivir, multiplicarse, mantener una población elevada y expresar ciertas actividades PGPR de interés bajo condiciones de estrés osmótico. Aparte esta bacteria posee capacidad endofítica y proporcionó efectos beneficiosos tales como cambios en la fisiología de la planta incluyendo acumulación de osmolitos y ajuste osmótico, regulación estomática y reducción del potencial de membrana, todo ello logra conferir alta tolerancia a la sequía de la planta (Compant et al. 2005; Ryan et al. 2008). La limitación de agua y el elevado estrés osmótico afectan negativamente el crecimiento tanto microbiano como de plantas. Pero la inoculación de una bacteria autóctona como B. thuringiensis fue capaz de atenuar efectos perjudiciales y mejorar el crecimiento, la absorción de nutrientes y la calidad fisiológica de las plantas. Tales mecanismos pueden ayudar a las plantas de L. sativa en los procesos de osmoregulación y en la mejora de los mecanismos homeostáticos al desafío del estrés (Dimkpa et al, 2009; Miller et al., 2010).
CAPÍTULO 2.
El restablecimiento de una cobertura vegetal sobre la base de especies vegetales autóctonas adaptadas a las condiciones ambientales locales, constituye la estrategia más eficaz para la recuperación de áreas degradadas en ambientes mediterráneos semiáridos (Vallejo et al., 1999). El éxito de los programas de revegetación de las zonas semiáridas se basa en el uso de tecnologías que benefician el establecimiento de las plantas autóctonas y mejoran su tolerancia a la sequía. Las plantas para sobrevivir dependen de sus sistemas de protección natural pero estos pueden ser potenciados por la ayuda de las actividades microbianas rizosféricas que intervienen en la adaptación al estrés. Así mismo, la gestión de las comunidades microbianas asociadas a la planta es otra estrategia relevante para atenuar el efecto negativo de factores perjudiciales, como la sequía (Azcón et al., 2013; Medina & Azcón, 2012; Dimkpa et al., 2009; Marulanda et al., 2009; 2003).
El estudio y selección de las poblaciones de rizobacterias autóctonas, puede considerarse una estrategia eficaz que contribuye a incrementar el potencial de microorganismos beneficiosos al ser aplicados en estos suelos semiáridos pobres e infértiles. El establecimiento de estas bacterias de manera temprana y el mantenimiento de su población es de interés para lograr su eficiencia. Por ello, la inoculación bacteriana y la selección de microorganismos específicos adaptados y eficaces, ha sido reconocida como una práctica interesante para aumentar el crecimiento vegetal (Zahir et al., 2004). Sin embargo, las respuestas de las plantas a la inoculación bacteriana no es generalizable e implica un control que abarca desde la cepa bacteriana a la especie de planta, e incluso el ecotipo y la características de la zona (Marulanda et al., 2009). Ciertos autores informan de que los efectos de las variables se determinaron en función de las especies de plantas, el cultivar y las condiciones ambientales (Nowak et al., 1998).
Las comunidades microbianas juegan un papel importante en la calidad del suelo, debido a las numerosas funciones que desempeñan en el ciclado de nutrientes, la transformación/descomposición de compuestos y otros procesos en los ecosistemas (Nannipieri et al., 2003). Varios estudios han demostrado que las especies vegetales tienen una importante influencia, incluso selectiva, sobre las comunidades microbianas que conforman sus rizosferas (Garland, 1996; Smalla et al., 2001). Los microorganismos del suelo sintetizan y secretan enzimas extracelulares que constituyen una parte importante de la matriz del suelo (Sinsabaugh et al., 1993). Actividades enzimáticas del suelo se han utilizado como indicadores del cambio en la calidad del suelo (Bastida et al., 2008; Hu et al., 2011). Hay informaciones que sugieren que las actividades enzimáticas del suelo disminuyeron en los ecosistemas mediterráneos debido a condiciones severas de sequía (Caravaca et al., 2002), y ello podría tener un efecto negativo en la disponibilidad de nutrientes.
La calidad del suelo está fuertemente influenciada por los procesos microbianos, y la función puede estar relacionada con la diversidad. Es probable que la estructura de la comunidad microbiana tenga el potencial de servir como indicador temprano de la degradación o estabilidad del suelo (Jackson et al., 2003; Aboim et al., 2008; Peixoto et al., 2010).
Las técnicas basadas en la biología molecular nos han facilitado la manera de caracterizar la estructura de la comunidad microbiana, y por lo tanto de controlar su dinámica. Hay interés ecológico en conocer la diversidad de los hongos micorrízicos arbusculares (MA) presentes en las raíces de las diferentes especies de plantas y las bacterias PGPR. Ello es de gran utilidad en los programas de revegetación que como en nuestro estudio se centran en los ecosistemas áridos utilizando arbustos autóctonos (Armada et al., 2014; Mengual et al., 2014).
Para abordar este estudio el presente capítulo se subdividió en tres subcapítulos;
2.1) Caracterización y gestión de las cepas bacterianas autóctonas de suelos semiáridos de España y sus interacciones con residuo agrícola fermentado para mejorar la tolerancia a la sequía en especies arbustivas nativas.
El objetivo del presente estudio fue aplicar las tres cepas bacterianas autóctonas tolerantes a la sequía (identificadas como Enterobacter sp.; Bacillus thuringiensis; Bacillus sp.) pertenecientes a los géneros predominantes. Como ya se ha expuesto, fueron aisladas de la rizosfera de especies arbustivas mediterráneas que crecen en un ambiente semiárido objeto de estudio. Además, se analizaron sus efectos y características PGPR en comparación con una cepa de referencia (Bacillus megaterium utilizado como cepa alóctona igualmente tolerante a la sequía). Para determinar la eficiencia como inoculantes se seleccionaron cuatro especies de arbustos autóctonos (Thymus vulgaris, Santolina chamaecyparissus, Lavandula dentata y Salvia officinalis) predominantes en la zona de estudio y adaptadas a la aridez. Además, se analizó su modulación e interacción por la aplicación de un residuo agrícola (sugar-beet) fermentado por Aspergillus niger para ser usado como compost.
Las rizobacterias que promueven el crecimiento vegetal (PGPR) juegan un importante papel en el sistema suelo/planta y por lo tanto en el medio ambiente. Por ello, ayudan al establecimiento y crecimiento de las plantas por varios mecanismos directos e indirectos (Kasim et al., 2013) que pueden aumentar la tolerancia a la escasez de agua de las plantas en situaciones de estrés hídrico (Naveed et al., 2014). De hecho, las PGPR han demostrado actividades que mejoran el balance hídrico de las plantas tanto bien regadas como estresadas (Kohler et al., 2008). Variables fisiológicas como la conductancia estomática, la tasa de transpiración y el potencial hídrico foliar generalmente se ven afectados por la inoculación bacteriana en condiciones limitadas de agua (Benabdellah et al., 2011). Los factores de estrés ambiental que afectan al ecosistema semiárido también alteran la diversidad y la densidad de las poblaciones microbianas pero los propágulos microbianos no desaparecen totalmente, y ello puede considerarse como una indicación de adaptación al estrés (Azcón et al, 2013; Barea et al., 2011). Los ecotipos microbianos tolerantes y adaptados a la sequía perviven naturalmente y ellos son los mejores candidatos para ser utilizados como inoculantes en los programas de reforestación bajo condiciones semiáridas y limitadas de agua (Alguacil et al., 2003; Caravaca et al., 2002).
Para evaluar las capacidades PGPR y de resistencia a la sequía de los aislados bacterianos autóctonos seleccionados, se usaron medios de cultivo con niveles crecientes de estrés osmótico y en ellos se determinaron las actividades bacterianas relacionadas con la bioestimulación de la planta tales como la producción de hormonas (SA, ABA, JA y AIA) y la solubilización de fosfato. También se evidenció la capacidad de tolerancia celular a la sequía, mediante la producción de prolina, poli-ß-hidroxibutirato (PHB), actividades enzimáticas antioxidantes [APX; CAT] y 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminasa. Así mismo, se evaluó el crecimiento potencial de las células bacterianas al incrementar en el medio el nivel de estrés osmótico. Los resultados muestran que en condiciones axénicas, la tensión osmótica aplicada no suprime las capacidades PGPR de las bacterias ensayadas lo que indica su potencial para ser usadas como inoculantes en condiciones de estrés osmótico.
En el bioensayo correspondiente, utilizando suelo natural, sequía, y las plantas y bacterias autóctonas seleccionadas, todas las bacterias inoculadas mejoraron la nutrición y las variables fisiológicas y bioquímicas relacionadas con la tolerancia a la sequía en las plantas. Destacando B. thuringiensis como la bacteria nativa más eficiente en incrementar el contenido de P en T. vulgaris y S. officinalis, y el contenido de K en L. dentata, (el cual decrece la conductancia estomática). La multiplicidad y complejidad de las actividades bacterianas y las características intrínsecas de reacción de cada planta a la sequía, podrían explicar los variables resultados de la inoculación bacteriana.
La aplicación del residuo agrícola fermentado (compost) obtenido de la fermentación de la remolacha azucarera también resultó efectivo. Esta enmienda interactuó positivamente con las bacterias inoculadas y el resultado fue el aumento de la absorción de nutrientes de las plantas y tolerancia a la sequía. Pero la eficacia de las bacterias inoculadas depende de las especies de plantas y bacterias implicadas. Así pues, la aplicación dual de B. megaterium y el residuo agrícola fermentado aumentó la captación de P y K en S. chamaecyparissus, L. dentata y S. officinalis y la disminución de la acumulación de prolina en L. dentata, lo que reflejó un incremento en la tolerancia a la sequía.
La actividad de bacterias específicas y/o residuo agrícola fermentado debe estar asociada a la protección de las plantas frente a este estrés consiguiendo aminorar los efectos negativos de la sequía y reducir así la consiguiente alteración de las características fisiológicas de las plantas. Las bacterias y el residuo agrícola fermentado protegen en mayor o menor medida (dependiendo de la planta implicada) frente el estrés por sequía, y podrían ser utilizados como una herramienta biotecnológica para aliviar la deficiencia de agua de la planta. Existen muchos factores que controlan el efecto PGPR, lo que hace difícil generalizar y explicar la causa/efecto de las variables de respuestas de las plantas. Pese a todo ello, los resultados obtenidos apoyan el hecho de que las bacterias seleccionadas y el residuo agrícola fermentado ayuda en la mayoría de los casos y debido a múltiples mecanismos, al establecimiento de las plantas y a la reforestación de suelos semiáridos.
2.2) Actividad diferencial de bacterias autóctonas en el control de estrés por sequía en especies de plantas nativas Lavandula y Salvia bajo condiciones de sequía en suelo áridos naturales.
Prosiguiendo el estudio anterior, se evaluó la eficacia de las rizobacterias autóctonas identificadas (Enterobacter sp.; Bacillus thuringiensis; Bacillus sp.) y la bacteria alóctona de referencia (Bacillus megaterium), capaz de promover el crecimiento vegetal (PGPR) en las especies vegetales L. dentata y S. officinalis en condiciones de invernadero usando un suelo árido mediterráneo natural y sequía.
Cada una de estas bacterias seleccionadas mostró diferente potencial para mejorar la limitación de agua y aliviar el estrés por sequía en estas dos especies de plantas. B. thuringiensis promueve el crecimiento y evita efectos de la sequía en L. dentata, al aumentar el contenido de K, deprimiendo la conductancia estomática y controlando la acumulación de prolina en la parte aérea vegetal. Estos efectos se relacionan con la disminución de la actividades antioxidantes glutatión reductasa (GR) y ascorbato peroxidasa (APX) que resultaron ser los mejores indicadores de sensibilidad y tolerancia a la sequía, y revelan menor daño celular oxidativo el cual está involucrado en la respuesta adaptativa a la sequía. En cambio, en S. officinalis, que tiene una menor relación intrínseca tallo/raíz, mayor conductancia estomática y menor actividad antioxidante APX y GR que L. dentata, los efectos bacterianos en la nutrición, fisiología y sistemas enzimáticos antioxidantes fueron menores. Las características particulares de las especies de plantas ensayadas parecen ser factores importantes en controlar la efectividad de la inoculación bacteriana.
En conclusión, L. dentata demostró un mayor beneficio que S. officinalis para controlar el estrés por sequía cuando se inocularon con B. thuringiensis. Pese a la tolerancia de esta bacteria a la sequía evaluada como supervivencia y su capacidad estimuladora a altos niveles de estrés osmótico (valores que mostraron el potencial de esta bacteria para ayudar a las plantas para crecer en condiciones de sequía) en el presente bioensayo se evidenció que B. thuringiensis solo resultó ser un inóculo eficaz para incrementar el establecimiento de las plantas de L. dentata.
2.3) Análisis de la comunidad microbiana por PLFA y pirosecuenciación en especies arbustivas autóctonas en condiciones de sequía y efecto de la inoculación de bacterias autóctonas en la diversidad microbiana.
El objetivo de esta parte del estudio se centra en explorar y conocer el rango de diversidad microbiana rizosférica que albergan determinadas especies vegetales autóctonas objeto de estudio. Para ello se emplearon dos técnicas, la determinación de los perfiles de ácidos grasos de fosfolípidos [phospholipid fatty acid (PLFA)] y la pirosecuenciación.
Los biomarcadores de ácidos grasos se utilizan en estudios de ecología microbiana del suelo ya que proporcionan información cualitativa y cuantitativa sobre las comunidades microbianas. El análisis de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFA) de las membranas microbianas, deriva del fraccionamiento de lípidos, determinados por los métodos propuestos por Frostegård et al., (1993a, b); Frostegård & Bååth, (1996); Zelles, (1997). Ello nos proporciona un conjunto de marcadores moleculares específicos de taxones microbianos que son utilizados para evaluar la composición de la comunidad microbiana del suelo y de la biomasa microbiana total viable (Bossio & Scow, 1995; White et al., 1996). La separación de los lípidos proporciona una fracción de ácido graso lipídico neutro [neutral lipid fatty acid (NLFA)] que informa acerca de las reservas de energía eucariota útiles en estudios relacionados con el estado nutricional de los hongos (Baath, 2003).
Los recientes avances en la tecnología de secuenciación, como es la secuenciación de próxima generación, permite evaluar la diversidad microbiana y la estructura de la comunidad microbiana en ambientes diferentes (Cristea-Fernstrom et al., 2007; Roesch et al., 2007). Los respectivos análisis nos aportó la información requerida sobre la identificación de las comunidades fúngicas destacando la correspondiente a los hongos micorrízicos arbusculares (MA) (empleando primers específicos) y las comunidades bacterianas. Ello nos ha permitido conocer el efecto de las distintas especies de plantas autóctonas seleccionadas (T. vulgaris; S. chamaecyparissus; L. dentata) en las comunidades de hongos MA y bacterias de los suelos naturales y sometidos a estrés hídrico, y los cambios que conlleva la inoculación bacteriana en la diversidad microbiana de cada planta.
Se seleccionó la cepa bacteriana nativa con mejores características como inoculante (B. thuringiensis) para comprobar su influencia, tras ser inoculada, sobre el desarrollo y supervivencia de las comunidades fúngicas (MA) y bacterianas en cada una de las rizosferas de las plantas autóctonas mencionadas.
De acuerdo a los resultados obtenidos, se confirma que la comunidad microbiana fue significativamente diferente en las rizosferas de las tres especies de plantas. Esas diferencias fueron detectadas por los biomarcadores bacterianos (C17:1w8c; C18:1w9t) y biomarcadores fúngicos (C18:1w9c; C18:2w6c). Sin embargo, la inoculación bacteriana parece que no influye significativamente en los perfiles de ácidos grasos.
Los resultados confirman que las rizosferas de S. chamaecyparissus y L. dentata poseen una mayor diversidad fúngica que T. vulgaris. Los datos demuestran que S. chamaecyparissus selecciona una mayor presencia de los phylum Ascomycota y Basidiomycota, mientras que L. dentata lo hace por el phylum Glomeromycota. Cabe destacar que la inoculación de B. thuringiensis promueve el incremento de miembros pertenecientes al orden Glomus en las tres especies vegetales, pero sobre todo en L. dentata.
La rizosfera de S. chamaecyparissus presentó baja diversidad bacteriana, pese a la alta actividad deshidrogenasa, pero destaca por una elevada actividad fosfatasa alcalina que se relaciona con el elevado contenido de P asimilable por la planta. Pero curiosamente la rizosfera de S. chamaecyparissus tras ser inoculada con la bacteria nativa B. thuringiensis es la que posee una mayor diversidad microbiana en general y particularmente de la comunidad bacteriana. Este tratamiento expresa un incremento en la actividad ureasa que se relaciona con la mayor diversidad bacteriana que posee, y por la comunidad fúngica que alberga.
La rizosfera de L. dentata que presenta una mayor actividad ß-glucosidasa puede relacionarse con alto valor de la comunidad bacteriana pero sobre todo de la comunidad fúngica. L. dentata es la especie vegetal que presenta en su rizosfera una mayor diversidad bacteriana y fúngica, destacando sobre todo el phylum Glomeromycota. Ello la diferencia de la especie T. vulgaris que destaca por una mayor diversidad bacteriana y de S. chamaecyparissus por alta diversidad fúngica. La inoculación de la bacteria nativa B. thuringiensis altera la diversidad microbiana en general, pero particularmente en la rizosfera de S. chamaecyparissus.
En conclusión, esta parte del estudio centrado en la diversidad microbiana según tipo de planta y los cambios motivados por la inoculación de B. thuringiensis ha proporcionado conocimiento sobre la caracterización de la composición de la rizosfera bacteriana y fúngica de los distintos tipos de cobertura vegetal autóctona en condiciones ambientales de semiáridez. Podemos decir que las especies arbustivas autóctonas contribuyen diferencialmente al desarrollo y enriquecimiento de las comunidades de hongos y de bacterias de estas zonas semiáridas. Además, tras inocular una especie bacteriana nativa de la misma zona con capacidad PGPR, se incrementó en cualquier planta las especies del phylum Glomeromycota y altero la diversidad bacteriana y fúngica de forma más o menos específica dependiendo de la especie vegetal. Tales efectos de la inoculación sobre la diversidad microbiana pueden contribuir a fomentar el desarrollo vegetal, la disponibilidad de nutrientes y por consiguiente la tolerancia a soportar esas condiciones tan extremas de deficiencia en agua propias de la zona de cultivo.
CAPÍTULO 3.
En este capítulo se planteó la hipótesis basada en seleccionar microorganismos más efectivos potenciando la tolerancia a la sequía en la planta autóctona L. dentata, se estudió la interacción de la bacteria autóctona más eficiente (B. thuringiensis) con hongos nativos formadores de micorrización arbuscular.
Este capítulo 3 se subdivide en dos subcapítulos;
3.1) Bacillus thuringiensis bacteria nativa promotora del crecimiento vegetal y su interacción con la mezcla o especies micorrízicas fúngicas individuales mejoran la tolerancia a la sequía y el metabolismo oxidativo en plantas de Lavandula dentata Se evaluó las respuestas de L. dentata a la inoculación individual o de la mezcla de las especies de hongos micorrízico arbusculares (MA) autóctonos más abundantes y la interacción de dichos hongos con B. thuringiensis en condiciones de sequía. Las especies de hongos se identificaron como (Septoglomus constrictum EEZ 198; Diversispora aunantia EEZ 199; Archaeospora trappei EEZ 200; Glomus versiforme EEZ 201; Paraglomus ocultum EEZ 202) Los hongos micorrízicos arbusculares (MA) tienen la capacidad de colonizar las raíces de la mayoría de las plantas vasculares, y potenciar su capacidad de resistir al estrés hídrico. Es ampliamente conocido que las micorrizas pueden ayudar a las plantas a prosperar en ecosistemas semiáridos (Azcón et al., 2013). El efecto de la asociación micorriza se basa en mecanismos directos e indirectos, ya que el micelio micorrízico, por su reducido diámetro, tiene mayor acceso que las raíces a los poros del suelo, por consiguiente, son más eficientes que las raíces para la extracción de nutrientes y agua (Azcón & Barea, 2010). Las plantas micorrizadas aumentan la absorción de nutrientes, especialmente los nutrientes menos móviles. Existen evidencias de que los hongos MA se adaptan a un amplio rango de condiciones edáficas, pero las diferencias en el comportamiento de las distintas especies de hongos en el crecimiento de la planta y en conferirle tolerancia al estrés, no son hechos generalizables debido a las características y actividades específicas del hongo en cuestión.
Como los estudios previos demuestran, la selección de microorganismos del suelo para lograr la mayor ayuda al establecimiento de la cubierta vegetal autóctona, bajo condiciones ambientales áridas, es un aspecto recomendable. Los resultados previos evidenciaron que las bacterias autóctonas tolerantes a la sequía, al ser inoculados incrementaron el crecimiento y la nutrición de las plantas. El conocimiento del papel de los hongos MA autóctonos como elementos bióticos primordiales en el tema que nos ocupa debía ser abordado en el presente estudio. Curiosamente, al interaccionar con la bacteria los resultados reflejan que la inoculación conjunta, pese a la diversidad y las capacidades intrínsecas de estos microorganismos, reducen el daño oxidativo a lípidos de la planta provocado por la sequía. La bacteria, además incrementó el desarrollo de la micorrización producida por la mayoría de las especies fúngicas ensayadas. Todo ello explica el mayor potencial de las plantas inoculadas dualmente con ambos microorganismos a tolerar el estrés por sequía. El consorcio y/o mezcla de distintos hongos MA y B. thuringiensis maximizan valores como la producción de biomasa vegetal y compensan en mayor medida, los efectos producidos por la sequía. Se detectó una reducción importante del daño oxidativo a lípidos [malondialdehído (MDA)] e incrementó las actividades antioxidantes [superóxido dismutasa (SOD), CAT y APX].
B. thuringiensis (bacteria endofítica) como ya fue previamente observado, mantiene su capacidad colonizadora a lo largo del tiempo, y el potencial para mejorar el crecimiento de las plantas en condiciones de estrés. Así mismo, provoca el aumento de la formación de arbúsculos producidos por la colonización de los hongos. Tal incrementó fue de un 545% en A. trappei, de un 294% en G. versiforme y de un 561% en P. occultum. Consecuentemente, tal efecto redunda en la funcionalidad simbiótica. Ciertas especies bacterianas han sido consideradas como bacterias que ayudan a la formación y/o efectividad de micorriza por su capacidad de promover el crecimiento de micelios, su establecimiento y/o la actividad de esta simbiosis (Frey-Klett et al., 2007). El mayor desarrollo arbuscular se observó en plantas colonizadas por el consorcio de hongos MA y B. thuringiensis.
Este estudio demostró que la mayoría de las especies de hongos MA autóctonos y en particular su consorcio fueron efectivas sobre el desarrollo vegetal particularmente en interacción con B. thuringiensis. La capacidad endofítica de esta bacteria la hace muy adecuada como inoculo para la protección de las plantas contra la sequía y ayudar a las plantas a prosperar en ecosistemas semiáridos.
3.2) Perfiles fisiológicos de comunidades rizosféricas bacterianas (estructura funcional) de rizosferas Lavandula dentata, y efecto de la inoculación (individualizada o mixta) con hongos micorrízicos autóctonos tolerantes a la sequía, y su interacción con Bacillus thuringiensis.
Se han investigado los perfiles fisiológicos de las comunidades bacterianas de la rizosfera de L. dentata crecida en condiciones de sequía, y el efecto que produce la inoculación con cada uno de los cinco hongos autóctonos formadores de micorrizas arbusculares (MA) o la mezcla de ellos y los cambios que origina la interacción de la cepa bacteriana nativa (B. thuringiensis).
La hipótesis planteada se basa en que si los aludidos inoculantes son capaces de modificar los parámetros de crecimiento de las plantas también deberían cambiar la composición de los exudados de las raíces de L. dentata (de los que dependen las comunidades bacterianas y el micelio de los hongos) bajo las condiciones de sequía ensayadas. Tales cambios, a su vez, podrían alterar los patrones de uso de las diferentes fuentes de C y N por las comunidades bacterianas de la rizosfera y micorrizosfera.
Los efectos de estos inoculantes microbianos se evaluaron mediante cambios en algunos parámetros biométricos de la planta, como contenido de C, micorrización total y porcentaje de colonización, así como proporción de agregados estables producidos en la rizosfera. Y se determinó que los microorganismos nativos inoculados incrementaron en general, el crecimiento de la planta y el contenido de C, pero la interacción de cada hongo MA con B. thuringiensis no siempre superó el efecto de la inoculación individual de cada hongo MA. Sin embargo, el consorcio o mezcla de hongos MA y B. thuringiensis, provocó el mayor desarrollo de biomasa aérea, de colonización micorrízica y de contenido de C vegetal. Este compuesto (C) es altamente eficaz en la protección de las plantas contra la sequía y el mantenimiento de la condición endofítica de los microorganismos inoculados. Así mismo, lo que se refiere a los cambios en los perfiles fisiológicos de las comunidades bacterianas de la rizosfera, hubo también claras diferencias producidas por las colonizaciones con los diferentes hongos MA mientras que no se modificó, de forma sustancial, por la inoculación con B. thuringiensis. Estos resultados indican que el principal factor que impulsa cambios en las comunidades bacterianas (evidenciado por los patrones de utilización de sustratos) es la especie de hongo MA colonizadora. El consumo rizosférico de hidratos de carbono parece ser más importante en las plantas colonizadas por S. constrictum y P. occultum independientemente de la co-inoculación de B. thuringiensis. El consumo de ácidos orgánicos predomina en la rizosfera de plantas colonizadas con el consorcio (o mezcla) de hongos MA y con D. aunantia. Pero el consumo de aminoácidos predomina en la rizosfera de plantas colonizadas por A. trappei.
Las diferencias encontradas en la diversidad funcional de las distintas rizosferas, según la inoculación de cada uno de los hongos practicada, sugiere que existe una alteración en la exudación de la planta debido a la simbiosis micorrízica según el colonizador. Y ello se refleja en el consumo de diferentes compuestos por las comunidades bacterianas rizosféricas de L. dentata. El conocimiento y la comprensión de los efectos de los hongos MA en la comunidad microbiana rizosférica como parte concomitante de los procesos de la inoculación, es esencial para entender los cambios en el sistema suelo/planta y obtener el máximo beneficio para el establecimiento vegetal donde los efectos de la sequía afectan profundamente la capacidad de desarrollo de la planta y la comunidad rizosférica bacteriana.
CAPÍTULO 4.
Potencial del inóculo micorrízico para estimular el crecimiento, nutrición y actividades enzimáticas en plantas de Retama sphaerocarpa comparado con la fertilización química bajo condiciones de sequía.
En este estudio se determinó que el crecimiento de Retama sphaerocarpa en condiciones de sequía, fue similarmente incrementado por la colonización del consorcio fúngico MA nativo o un hongo de referencia Rhizophagus intraradices alóctono que por la aplicación de dos niveles de fertilizante fosforados [25 ppm de P o 50 ppm de P].
La hipótesis que se planteó es que bajo condiciones de sequía, la planta autóctona (R. sphaerocarpa) se beneficiará en mayor medida de la inoculación con todo un consorcio de hongos MA nativos, debido a la diversidad y la funcionalidad de la comunidad micorrízica autóctona, que de la inoculación con un hongo alóctono de referencia adaptado a sequía como R. intraradices (EEZ 195). Presumiblemente, la inoculación con una comunidad fúngica heterogénea tendría una mayor capacidad para mitigar los complejos efectos del estrés hídrico que un sólo inóculo fúngico (Caravaca et al., 2005).
En general, el efecto beneficioso de la micorrización se asocia con la adquisición de fósforo en las plantas colonizadas. La micorrización aumenta la absorción de P de la planta y esto es un mecanismo importante en relación con la tolerancia de las plantas a la sequía (Augé, 2004; Subramanian et al., 2006). Además, la micorriza arbuscular fue determinante disminuyendo la actividad antioxidante GR con respecto a plantas fertilizadas de similar biomasa. La actividad antioxidante APX se incrementó por la fertilización de P y disminuyó en plantas colonizadas por MA de tamaño y nutrición similar lo cual reveló la protección directa de dichos hongos MA contra la sequía por medio de mecanismos no nutricionales. Los hongos nativos producen similar biomasa aérea y nutrición que la fertilización con 50 ppm de P. Sin embargo, la micorrización reduce las actividades antioxidantes CAT y APX indicando que las plantas micorrizadas soportan un estrés hídrico más bajo.
Por otro lado, en un estudio posterior, se valoró si la mezcla de inóculos autóctonos [consorcio de hongos MA (M) más B. thuringiensis (B)] es capaz de fortificar la fertilización de K2SO4 [5 mM K o 10 mM de K] en R. sphaerocarpa bajo condiciones de sequía. La interacción fertilizante químico (K) y los inóculos aplicados incrementó el contenido de nutrientes solamente en plantas fertilizadas con 5 mM K, mientras que, la fertilización con mayor proporción de K incluso disminuyó el desarrollo arbuscular. La reducción de las actividades antioxidantes superóxido dismutasa (SOD) y APX, y la eliminación de las actividades CAT y GR en las plantas co-inoculadas y fertilizadas con menor proporción de K, indica que el alto potencial de los inóculos para hacer frente a la sequía es dependientemente del nivel de fertilidad del suelo y la nutrición vegetal.
En estos dos ensayos, los inóculos aplicados incrementaron en mayor medida que los fertilizantes las actividades enzimáticas del suelo, especialmente la ß-glucosidasa. La mejora de las propiedades del suelo (indicadoras de su calidad) estimulan indirectamente el crecimiento de las plantas.
Los resultados muestran que la inoculación con hongos MA nativos y/o bacterias puede ser una herramienta eficaz para sustituir y/o potenciar el efecto de los fertilizantes químicos. Las cepas autóctonas están presumiblemente pre-adaptados a las condiciones semiáridas y, por tanto, son colonizadores competitivos en su suelo original y en condiciones de sequía.
Curiosamente, en condiciones de baja fertilidad las cepas nativas resultaron ser colonizadores más eficaces, sobre todo en cuanto a la abundancia arbuscular y a la riqueza e intensidad de micorrizas. Estos desarrollos simbióticos promovieron un aumento en la captación de N y P. Leguminosas leñosas como R. sphaerocarpa son plantas colonizadoras útiles para suelos áridos deficientes en nutrientes (Caravaca et al., 2004).
CAPÍTULO 5.
Uso de hongos micorrízicos arbusculares y Bacillus thuringiensis autóctonos de zonas Mediterráneas degradas para mejorar los rasgos fisiológicos y de resistencia a la sequía de una planta alóctona de interés agronómico (maíz).
Este estudio investiga la eficacia de microorganismos autóctonos adaptados a la sequía [B. thuringiensis y un consorcio de hongos micorrízicos arbusculares (MA)] de una zona mediterránea degradada, para mejorar el crecimiento y la fisiología en Zea mays L. en condiciones de déficit y suficiencia hídrica. Así mismo, el uso de esta planta permite realizar estudios de biología molecular relacionados con la expresión de genes acuaporinas.
Este estudio ha demostrado que microorganismos autóctonos aislados de ambientes áridos son también beneficiosos cuando se utilizan como inóculo en plantas alóctonas de interés agronómico.
Las plantas de maíz (Zea mays L.) fueron inoculadas o no con los aislados autóctonos [B. thuringiensis, un consorcio de hongos MA o una combinación de ambos microorganismos]. Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de buen riego o sometidas a estrés por sequía. Los inóculos aplicados aumentaron en maíz la eficiencia fotosintética, y la conductividad hidráulica de la raíz, también se estudió el daño oxidativo a lípidos, la acumulación de prolina y la síntesis de compuestos antioxidantes, y la expresión de genes relacionados con la expresión de acuaporina de la planta.
Los efectos más importantes de los microorganismos inoculados se detectaron bajo condiciones de sequía. La inoculación de B. thuringiensis aumentó significativamente la acumulación de nutrientes. La inoculación combinada de ambos microorganismos disminuyó el daño oxidativo a lípidos y la acumulación de prolina, inducida por la sequía. Así mismo, acuaporinas de maíz capaces de transportar agua, CO2 y otros compuestos, fueron reguladas por los inoculantes microbianos. El impacto de estos dos tipos de microorganismos en la tolerancia de la planta a la sequía fue complementario, B. thuringiensis estimuló principalmente la nutrición de las plantas, y los hongos MA fueron más activos mejorando los mecanismos homeostáticos y de tolerancia al estrés, incluyendo la regulación de acuaporinas de la planta concomitantemente con ciertas funciones fisiológicas.
Por lo tanto, el uso de microorganismos beneficiosos autóctonos de un área mediterránea degradada, es útil para proteger no sólo las plantas nativas contra la sequía, sino también una planta agronómicamente importante, tal como el maíz.
CONCLUSIONES GENERALES.
·Las especies bacterianas aisladas de las rizosferas de arbustos autóctonos de zonas semiáridas, pertenecen mayoritariamente a los géneros Bacillus y Enterobacter. Se seleccionaron en base a su capacidad de tolerancia al estrés y mantenimiento de las capacidades PGPR más representativas.
·La actividad de las bacterias seleccionadas es potenciada por el residuo agrícola fermentado. Su aplicación conjunta, en suelo natural, incrementó la tolerancia de las plantas a la sequía mejorando la nutrición, actividades antioxidantes y características fisiológicas.
·La eficiencia de las bacterias seleccionadas no sólo depende de sus inherentes capacidades promotoras del crecimiento vegetal sino de las características de las plantas inoculadas.
·Bacillus thuringiensis fue más efectivo en Lavandula dentata que en Salvia officinalis y el efecto se asocia con un aumento en el contenido de K, disminución de la conductancia estomática, prolina y actividades enzimáticas antioxidantes lo que evidencia el efecto de la bacteria en la tolerancia a la sequía de L. dentata.
·La inoculación de B. thuringiensis en las distintas especies vegetales incremento la diversidad microbiana y provocó cambios en la composición bacteriana y fúngica rizosférica en condiciones de sequía. B. thuringiensis promovió la presencia de miembros del género Glomus en todas las especies vegetales, sobre todo en L. dentata.
·La especie de hongo MA colonizadora altera las comunidades bacterianas rizosféricas en mayor medida que la inoculación con B. thuringiensis.
·La interacción de B. thuringiensis con el consorcio de hongos MA autóctonos, demostró mayor protección de las plantas contra la sequía que su interacción con cada una de las especies fúngicas.
·Los hongos MA y bacterias autóctonas seleccionadas pueden sustituir y/o potenciar en la planta el efecto de los fertilizantes químicos en condiciones de aridez. Además los inoculos mejoraron las características físico-químicas del suelo.
·El uso de microorganismos beneficiosos autóctonos de un área árida, protege no sólo las plantas nativas contra la sequía, sino también fueron efectivos al inocularse en una planta de importancia agronómica, como el maíz. Destacamos que B. thuringiensis afectó principalmente la nutrición vegetal, y los hongos MA mejoraron los procesos homeostáticos y de tolerancia, incluyendo la regulación de las acuaporinas de la planta.
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