Monitorització i control del procés de producció de proteïnes heteròlogues en el llevat metilotròfic Pichia Pastoris
- Autores: Oriol Cos Busquets
- Directores de la Tesis: José Luis Montesinos Seguí (dir. tes.), Francisco Valero Barranco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2006
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manel Poch Espallargas (presid.), Carles de Mas Rocabayera (secret.), Francisco Javier Lafuente Sancho (voc.), Jordi Xavier Feliu Gil (voc.), Eugenio Manuel De Faria C. Ferreira (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Aquest treball es centra en la investigació sobre la producció de proteïnes heteròlogues en el llevat metilotròfic Pichia Pastoris. El principal avantatge de la utilització daquest sistema dexpressió és lexistència del promotor dalcohol oxidasa, un dels més eficaços i fortament regulats per la presència de metanol com a única font de carboni. El gen hoste emprat és la lipasa del fong Rhizopus oryzae, proteïna delevat interès industrial i biotecnològic per les seves nombroses i variades aplicacions.
De quatre tipus de soques diferents, dos parelles de diferent fenotip (Mut+ i Muts) i dins el mateix fenotip amb una o vàries còpies del gen hoste, sha seleccionat la soca més adient, en aquest cas Muts singlecopy, per una posterior explotació en cultiu semicontinu segons criteris de productivitat i dinàmica de creixement.
Sha observat que un dels problemes que presenta aquest tipus de cultiu és la reproductibilitat i el control de la concentració de metanol que saconsella no superar els nivells considerats com a tòxics de 10 gl-1. Diferents mesures com lanàlisi de la composició dels gasos de sortida del fermentador, lextracció automàtica de mostres i la gestió de tota la informació del cultiu des de un programari dissenyat específicament, milloren significativament el seguiment i el control del cultiu. La disponibilitat de noves mesures del cultiu permeten estimar variables destat com la biomassa i la velocitat específica de creixement que són molt útils per conèixer el estat fisiològic del microorganisme.
Per aconseguir mantenir estable la concentració de substrat inductor sha proposat utilitzar un llaç de control en retroalimentació començant pels sistemes de control més clàssics basats en lerror. La dinàmica canviant del sistema i el temps mort també variable fa que controls de tipus on-off i Proporciona Integral no siguin adients per mantenir prou estable la concentració de substrat. Com alternativa, sha implementat amb èxit un controlador predictiu basat en model que sadapta contínuament al consum canviant de substrat inductor.
Utilitzant de forma conjunta totes les millores instrumentals i de control del procés sha observat la influència que té la concentració de metanol sobre la producció de proteïna. Daquest estudi sen dedueix que mantenir la concentració a 1 gl-1 durant el cultiu pot augmentar de forma significativa la productivitat. Parallelament es defineix que per maximitzar la productivitat la durada del cultiu ha de ser al voltant de les 80- 90h.
Es pot afirmar que la installació dinstrumentació juntament amb lestimació, modelització i control dalgunes de les variables principals del cultiu, són mesures que permeten millorar la producció extracellular de proteïnes heteròlogues en Pichia Pastoris.
_________________________________________________ In this work the production of heterologous proteins by the methilotrophic yeast Pichia Pastoris has been studied. The main advantage of this expression system is the existence of a strong and tightly regulated (methanol-inducible) promoter from the alcohol oxidase gene (PAOX1).
Using a battery of four strains, which secrete a Rhizophus oryzae lipase (ROL), the combined effects of gene dosage and Mut phenotype on recombinant protein production by P. pastoris were observed in fed-batch cultures. This study concludes that the use of Muts ROL single copy strain is advantageous because it allows easier process control strategies with high productivity.
One of the main problems of these cultures is the low reproducibility and the need of accurate control of the methanol concentration in the fermentation to maintain it below toxic limits, 10 gl-1. The implementation of exhaust gas analyzer, an autosampler system and specific software to on-line administrate the culture information improved significantly the control of the bioprocess.
With several of these on-line measures it has been implemented an estimation algorithm that allows to determine both the specific growth rate of the microorganism and biomass concentration, used as physiologic indicators.
To control the methanol concentration at an optimal set-point level during the cultivation, a feedback control using different error based controllers has been implemented. The use of on-off and PI (Proportional Integral) controllers is not recommended due to the dynamics of the biological system and the large death time of the system. As alternative, a predictive control algorithm based on the on-line estimation of the methanol rate has been successfully implemented.
The improvement of the instrumentation and control of the bioprocess has provided the tools for the study of the influence of the methanol concentration on protein production. It has been observed that if the methanol concentration is maintained at 1 gl-1 productivity increase about 140% is produced. Moreover, it suggested that to maximize the productivity of the system, the duration of the fed-batch fermentation should be around 80-90 h.
The implementation of new instrumentation jointly with the use of software sensors, the modeling of the bioprocess, and the control of some of the fermentation variables significantly improved the production of the extracellular heterologous Rhizopus oryzae lipase by the yeast Pichia pastoris.
