Actividad antioxidante de polifenoles de vino tinto tras digestión in vitro e ingesta dietética
- Autores: María Ángeles Noguer Moreno
- Directores de la Tesis: María del Carmen García Parrilla (dir. tes.), Ana María Troncoso González (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Herminia López García de la Serrana (presid.), Ángeles Mencía Jos Gallego (secret.), Belén Puertas García (voc.), Fernando Granado Lorencio (voc.), María Teresa Morales Millán (voc.)
- Materias:
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- Resumen
1. INTRODUCCIÓN La defensa frente al daño oxidativo producido por los radicales libres en el organismo viene determinada por la acción de los antioxidantes endógenos (ácido úrico, bilirrubina, albúmina, GSH/GSSG y enzimas antioxidantes como catalasa, glutation reductasa, glutation peroxidasa, superóxido dismutasa¿.) y los antioxidantes exógenos que aporta la dieta (vitamina C, vitamina E, Selenio, carotenoides o los compuestos fenólicos).
Los compuestos polifenólicos son antioxidantes y su actividad depende de su estructura química (Villaño et al, 2005; Villaño et al, 2007; Wright et al, 2010; Chapado et al, 2010; Amorati et al, 2012; Pahari et al, 2012;). Los valores de actividad se han determinado haciendo reaccionar patrones de estas sustancias frente a radicales generados en el medio. Si bien este diseño es válido para los monómeros más sencillos, en los alimentos, entre ellos el vino, existen moléculas de mayor complejidad formadas por reacciones de condensación y polimerización. Si bien pueden proceder directamente de la uva en su mayor parte se originan por condensación entre sí mismas y por reacción de los compuestos polifenólicos con las nuevas sustancias que se van formando a lo largo de la fermentación tales como el etanol o acetaldehído. El análisis del material polimérico de naturaleza polifenólica no está resuelto pues la gran complejidad estructural dificulta la interpretación de los resultados; las técnicas cromatográficas más corrientes resuelven compuestos de menor peso molecular y no existen sustancias comerciales que puedan servir como estándares. Resulta pues un reto analítico que requiere un diseño experimental diferente a los planteamientos usados hasta la fecha. Nos obstante a pesar de este desconocimiento es de suponer su contribución al efecto saludable del alimento. El tamaño de los polímeros hace que no puedan ser absorbidos en la porción superior del tracto gastrointestinal pero son responsables del 50% de la actividad antioxidante total del vino (Fernández-Pachón et al, 2004). Su efecto debe ser ejercido en la luz intestinal por las sustancias que resulten de la digestión del alimento. Este aspecto inédito se explora en la presente memoria.
1 Resumen Estos métodos in vitro permiten evaluar el orden de actividad y el posible sinergismo con otras sustancias, no obstante, resulta necesario realizar estudios in vivo que validen los resultados in vitro. Resulta interesante comprobar si el consumo de vino desalcoholizado modifica marcadores relacionados con la actividad antioxidante, el aporte de polifenoles en ausencia de alcohol permite verificar el efecto de los compuestos polifenólicos exclusivamente.
2. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1 Digestión in vitro y Actividad antioxidante de fracciones de vino tinto separadas por Cromatografía Contracorriente (CCC).
Se sometieron 6 L de vino de la variedad Monastrell a un proceso de extracción. Utilizando una columna de Amberlita XAD-7 y usando como solvente metano/ácido acético (19:1). Se obtuvo un extracto que se sometió a cromatografía contracorriente (solventes: MTB/n-butanol/acetonitrilo/agua (2,75:1,25:1:5)). Las diferentes fracciones así obtenidas se sometieron a una digestión gástrica e intestinal (USP23, NF28) para comprobar el efecto de las digestiones sobre el material polimérico y realizar un acercamiento más ajustado a los procesos in vivo. Se estudió la composición fenólica de estas fracciones antes de la digestión, tras la digestión gástrica y tras la intestinal mediante HPLC/MS. Además se realizó un estudio de su actividad antioxidante mediante los ensayos ORAC y FRAP.
2.2 Estudio de la interacción de los antioxidantes endógenos y exógeno: actividad antioxidante y cinética Se prepararon disoluciones acuosas de patrones de distintos antioxidantes (ácido úrico, ácido ascórbico) y metabolitos de compuestos polifenólicos (Ac. protocatéquico, Ac. 3,4-dihidroxifenilacético, Ac. 3,4-dihidroxifenilpropiónico, Ac. 3-hidroxifenilacético). Se preparan en mezcla de una concentración 0.416mM; esta concentración coincide con el nivel plasmático máximo de ácido úrico en plasma, de forma que todos los metabolitos se encuentren en igual concentración y se pueda realizar una comparación de los resultados. Se 2 Resumen analizó la actividad antioxidante estos compuestos tanto de forma aislada como en todas las combinaciones posibles mediante los métodos ORAC y FRAP.
Por otra parte se realizó un estudio cinético para determinar el orden de reactividad de los distintos antioxidantes.
2.3 Modulación de la actividad de las enzimas antioxidantes tras la ingesta de vino desalcoholizados en una intervención con voluntarios humanos Se realizó una intervención de forma cruzada y aleatorizada con voluntarios humanos (n=8). Durante una primera fase un grupo de voluntarios siguieron la dieta baja en compuestos polifenólicos y bebieron 300 ml del vino desalcoholizado y el otro grupo (n=4) sólo siguieron la dieta. En el segundo periodo de la intervención los grupos se intercambiaron. Se tomaron ocho muestras de sangre, cuatro en cada período y se determinaron marcadores bioquímicos (ALT, AST, GGT, PCR, HDL, LDL, VLDL y triglicéridos), actividad antioxidante mediante los métodos ORAC y FRAP y la actividad de las enzimas antioxidantes (GR, GPx, CAT, SOD).
3. RESULTADOS 2.1 Digestión in vitro y Actividad antioxidante de fracciones de vino tinto obtenidos por Cromatografía Contracorriente (CCC).
Se ha determinado que la actividad antioxidante in vitro de la fracción I (comprende la mayor cantidad de compuestos poliméricos) es mayor que las fracciones II (correspondiente a malvidin-3-glucósido), fracción III (peonidina-3-glucósido), fracción IV (vitisina A) en el vino tinto de la variedad Monastrell analizado.
Tras la digestión gástrica e intestinal la actividad antioxidante in vitro de las fracciones de los polímeros de los compuestos fenólicos llega a aumentar 100 veces.
3 Resumen 2.2 Estudio de la interacción de los antioxidantes endógenos y exógenos: actividad antioxidante y cinética De los antioxidantes estudiados el ácido ascórbico y el ácido 3,4-dihidroxifenilpropiónico actúan por un mecanismo HAT, el ácido 3,4-dihidroxifenilacético, por un mecanismo SET. El ácido úrico, el ácido protocatéquico y el ácido 3-hidroxifenilacético pueden actuar indistintamente por uno u otro mecanismo.
El método FRAP fue puesto a punto por Benzie y Strain que establecieron el tiempo de medida en cuatro minutos. Sin embargo, ciertos antioxidantes, como el 3,4¿dihidroxifenilacético, requieren un tiempo superior para que la reacción esté concluida y el valor de actividad antioxidante sea más exacto.
Se han realizado 19 experiencias para evaluar el sinergismo de los compuestos fenólicos con antioxidantes endógenos. Sólo se ha podido demostrar sinergismo en el caso del ácido ascórbico con ácido 3,4-dihidroxifenilacético empleando el método ORAC para la determinación y entre el ácido ascórbico, ácido úrico y ácido protocatéquico deteminado si se emplea el método FRAP.
2.3 Modulación de la actividad de las enzimas antioxidantes tras la ingesta de vino desalcoholizados en una intervención con voluntarios humanos La ingesta de vino desalcoholizado (300 ml) durante una semana modifica la actividad de las enzimas antioxidantes: glutation reductasa, catalasa y superóxido dismutasa. Una dieta baja en compuestos fenólicos durante una semana disminuye la actividad de estas enzimas.
Los antioxidantes endógenos (ácido úrico, bilirrubina y albúmina) así como los parámetros bioquímicos analizados (GGT, PCR, HDL, LDL, VLDL y triglicéridos) no presentaron cambios significativos tras la intervención dietética.
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