Resumen de Acción protectora de la L-carnitina en la nefropatía hipertensiva
La hipertensión arterial (HTA) produce, entre otros, un daño estructural y funcional del riñón que conduce a la insuficiencia renal. El conocimiento de la fisiopatología subyacente tras este daño orgánico ayudaría a prevenir y tratar aquellos eventos renales producidos como consecuencia de la elevación sostenida de la presión arterial. De ahí la importancia de encontrar fármacos que, además de controlar las cifras de presión arterial, actúen previniendo y/o paliando las alteraciones orgánicas asociadas a la HTA. La L-carnitina (LC) es una amina cuaternaria necesaria en el transporte de ácidos grasos hacia el interior de la mitocondria para la obtención de energía metabólica, por lo que un déficit de este compuesto alteraría el metabolismo de lípidos y disminuiría la producción de energía celular. El riñón desempeña un papel muy importante en la homeostasis de la LC en el organismo, ya que, además de reabsorber más de 95% de la LC filtrada en el glomérulo, es un lugar importante para su síntesis; por tanto, un daño renal podría conducir a una deficiencia de este compuesto. Aunque la LC se administra hoy día como suplemento energético, existen otros mecanismos de acción desconocidos que justificarían su uso en determinadas patologías, como en el caso de enfermedades cardiovasculares y en pacientes que son sometidos a hemodiálisis.
Según lo anteriormente expuesto, nuestra hipótesis de trabajo se basa en que la LC podría actuar atenuando los procesos fisiopatológicos implicados en el daño renal asociado a la HTA. Por ello, hemos diseñado un estudio que nos permite abordar, desde un punto de vista funcional y molecular, los efectos nefroprotectores de la LC en la HTA. Con este fin, hemos utilizado ratas Wistar macho que hemos dividido en 4 grupos experimentales de 8 ratas por grupo: ratas control (grupo Wistar), ii) ratas tratadas con 400 mg de L-carnitina/kg de peso/día (grupo WLC), iii) ratas tratadas con 25 mg de L-NAME /kg de peso/día (grupo LN) y iv) ratas tratadas simultáneamente con L-NAME y LC (grupo LNLC). El tratamiento con LC se mantuvo durante 12 semanas, mientras que el tratamiento con L-NAME, en su caso, comenzó dos semanas más tarde que el de LC, manteniéndose por tanto durante 10 semanas.
Semanalmente, se determinó el peso corporal y los valores de presión arterial sistólica y diastólica (PAS y PAD) de los animales. Como cabía esperar, las ratas tratadas con L-NAME presentaron cifras significativamente elevadas de PAD y PAD, comparado con el grupo Wistar. En el grupo LNLC se observó una disminución significativa de las cifras de presión arterial, aunque no se llegaron a alcanzar los valores normales.
Para valorar la función renal de los animales, determinamos el grado de proteinuria y el aclaramiento de creatinina. Ambos parámetros se vieron alterados en las ratas hipertensas, las cuales presentaron una elevación en el grado de proteinuria y una disminución en el aclaramiento de creatinina. Estos datos ponen de manifiesto una pérdida de función renal en este grupo de animales. Tras el tratamiento simultáneo con LC, ambos parámetros volvieron a la normalidad, demostrándose así el efecto nefroprotector de la LC en este modelo experimental de hipertensión.
Con el fin de entender los mecanismos moleculares implicados en el efecto mediado por la LC, hemos realizado una serie de estudios para evaluar los efectos sobre el grado de estrés oxidativo, procesos inflamatorios y procesos fibróticos en la corteza renal. Hemos estudiado las actividades de diversas enzimas relevantes mediante técnicas espectrofotométricas; se ha evaluado la expresión génica mediante técnicas de PCR a tiempo real, y hemos analizado la expresión proteica mediante Western blotting e inmunohistoquímica. Además, con el fin de analizar la morfología del tejido renal, hemos realizado distintos estudios histológicos con tinciones de tricrómico de Masson y Rojo Sirio, lo que nos ha permitido evaluar el grado de fibrosis en los 4 grupos experimentales.
El estudio de la capacidad antioxidante demostró que las ratas tratadas con L-NAME presentan un aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), que causan daño orgánico, así como una disminución en la actividad y expresión génica y proteica de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa (GPx), ocurriendo lo contrario en el caso de la enzima glutatión reductasa (GR). Todos estos parámetros se restablecieron hasta valores normales tras el tratamiento conjunto con LC, de modo que este compuesto ejerce una capacidad para restablecer el sistema antioxidante a nivel renal en las ratas hipertensas. Además, las ratas hipertensas presentaron una mayor actividad de la enzima NADPH oxidasa, que está considerada como la mayor fuente de producción de radicales libres en el sistema renal. Las subunidades de la NADPH oxidasa (NOX2, NOX4, p22phox, p40phox, p47phox y p67phox) presentaron mayores niveles de expresión génica en las ratas L-NAME. Además NOX4 también se mostró elevada a nivel de expresión proteica en dicho grupo de animales. El tratamiento con LC a estas ratas revirtió estos parámetros a cifras similares a las del grupo control. El grupo control tratado con LC (grupo WLC) no mostró diferencias significativas con respecto al grupo Wistar en ninguna de estas determinaciones.
Una gran cantidad de estudios, tanto en humanos hipertensos como en modelos experimentales, han demostrado la participación del sistema renina angiotensina (SRA) en la fisiopatología de la HTA. El tratamiento con L-NAME produce un aumento de la expresión génica de la ECA (enzima convertidora de angiotensina) y del receptor AT1 de angiotensina II, conduciendo de esta forma a un aumento en la síntesis y acciones de la esta sustancia a nivel renal. Esta activación del SRA trae consigo un aumento en la actividad de la enzima NADPH oxidasa, con el consiguiente incremento en la producción de ROS. Los resultados de nuestro estudio apoyan esta asociación, ya que nuestro grupo de ratas hipertensas presenta una mayor expresión génica de ECA y del receptor AT1, y como consecuencia una mayor actividad NADPH oxidasa. En el grupo LNLC, el tratamiento con LC estabilizó los niveles de expresión génica de estos dos parámetros hasta valores similares a los controles, mostrando de esta forma que la LC ejerce su acción nefroprotectora en parte a través de su acción sobre el SRA. Con el fin de entender las vías por las cuales la LC ejerce su efecto antioxidante, hemos determinado la expresión génica del factor de transcripción Nrf-2. Este factor favorece la expresión génica de las encimas del sistema antioxidante. Las ratas tratadas con L-NAME presentaron una disminución significativa en la expresión génica de Nrf-2, con respecto al grupo control. Tras el tratamiento con la LC, los valores volvieron a la normalidad.
En cuanto al efecto de la suplementación con LC sobre los procesos inflamatorios en la nefropatía hipertensiva, las ratas hipertensas presentaron niveles elevados de las interleucinas (IL) proinflamatorias IL-1ß y IL-6, así como un descenso significativo en la interleucina antiinflamatoria IL-10, a nivel de la corteza renal. La administración simultánea de LC consiguió restablecer dichos valores hasta cifras controles. Con el fin de conocer con más detalle cómo el tratamiento con LC consigue ese efecto antiinflamatorio en las ratas con hipertensión arterial, hemos determinado la expresión génica del factor de transcripción NF-¿B, factor clave en el desarrollo de procesos inflamatorios. Este factor se mostró sobreexpresado en ratas L-NAME con respecto al grupo control; sin embargo, en el grupo LNLC, la LC consiguió disminuir la acusada elevación de este parámetro, devolviendo los valores a las cifras presentadas por el grupo Wistar. Estos resultados parecen indicar que la LC ejerce un efecto antiinflamatorio en el riñón de ratas hipertensas, y que este efecto está, al menos en parte, mediado por su acción sobre el factor de transcripción NF-¿B.
Tras poner de manifiesto los efectos antioxidantes y antiinflamatorios de la LC, nos preguntamos qué efecto tendría la suplementación con este compuesto en otro de los procesos clave en la HTA, como es el desarrollo de fibrosis renal. La fibrosis se caracteriza por la acumulación desmesurada de componentes de la matriz extracelular (como colágeno I y III), lo que acaba provocando un disfunción orgánica. Nuestras ratas hipertensas presentaron un acusado incremento en el área de fibrosis (tanto a nivel tubulointersticial como a nivel mesangial), así como una disminución en el área corpuscular. Los estudios de expresión génica de las moléculas de colágeno tipos I y III mostraron un fuerte incremento de estos parámetros en las ratas tratadas con L-NAME. Sin embargo, el exceso del área de fibrosis, así como la acusada elevación en la expresión génica de colágeno I y III, no estuvieron presentes en el grupo LNLC, lo que muestra la capacidad antifibrótica de la LC en el riñón de estos animales. Además, para dilucidar las vías moleculares implicadas en este efecto, medimos la expresión de dos moléculas clave en el proceso de fibrogénesis, factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß) y factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF). Ambos factores se vieron incrementados en las ratas tratadas con L-NAME. Además, TGF-ß se mostró significativamente elevado en los estudios inmunohistoquímicos (tanto a nivel tubulointersticial como a nivel glomerular), en este grupo de animales con respecto al grupo control. La suplementación conjunta con LC revirtió los valores de ambos parámetros, mostrando de esta forma que su efecto antifibrótico reside en la regulación de estos factores.
Aunque existe abundante bibliografía acerca de los efectos antioxidantes y antiinflamatorios de la LC, los mecanismos moleculares por los cuales actúa continúan siendo un misterio. En este trabajo, nosotros mostramos por primera vez los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antifibróticos de este compuesto en la nefropatía hipertensiva. Además, hemos querido indagar en los mecanismos implicados en este efecto. A este respecto, en la última década está cobrando interés la relación entre la familia de factores de transcripción PPAR (receptor activado por el proliferador de peroxisomas) y la LC. Esta familia de factores de transcripción está siendo altamente estudiada por su implicación en distintas enfermedades cardiovasculares, y ha mostrado tener un papel importante en la homeostasis de la LC, ya que participa en la regulación de la expresión génica de enzimas claves en su síntesis, así como en la expresión del transportador OCTN2 (organic cation transporter novel 2), que introduce la LC hacia el interior de los tejidos.
Además de lo anteriormente indicado, existen teorías que apuntan a dos miembros de la familia PPAR (PPAR¿ y PPAR¿) como mediadores de los efectos beneficiosos de la suplementación con la LC, pudiendo ser estas moléculas la clave para entender los mecanismos de acción de la carnitina. Por esta razón, hemos determinado la expresión génica de PPAR¿ y PPAR¿ en la corteza renal de nuestros cuatro grupos experimentales, así como la expresión proteica de PPAR¿. La expresión de ambos miembros de la familia PPAR se ve disminuida significativamente en las ratas hipertensas con respecto al grupo control, y el tratamiento simultáneo con LC eleva las cifras hasta alcanzar valores normales. Tras obtener estos resultados positivos, decidimos realizar un estudio in vitro, utilizando para ello células NRK-52E (células tubulares renales de rata), con el fin de descubrir si los efectos antifibróticos ejercidos por la LC a nivel renal estaban mediados por PPAR¿. Para ello, diseñamos un experimento con 6 grupos experimentales: (1) grupo control (sin ningún tipo de tratamiento); (2) células estimuladas con el agente profibrótico TGF-ß (10 ng/mL); (3) células estimuladas con TGF-ß y LC (1mM); y (4-6) tres grupos de células estimuladas con TGF-ß, LC y tres concentraciones crecientes (10 µM, 30 µM y 100 µM) del inhibidor de PPAR¿, GW9662. Los resultados mostraron cómo la estimulación con TGF-ß causaba una elevación significativa en la expresión génica del factor profibrótico CTGF, y que esta elevación era revertida por la LC. Sin embargo, en los grupos tratados con el inhibidor de PPAR¿, la LC no ejerce un efecto tan acusado; de hecho, en el grupo tratado con 100 µM del inhibidor de PPAR¿ observamos un aumento significativo de la expresión de CTGF con respecto al grupo control. Estos resultados muestran que el efecto antifibrótico de la LC está, al menos en parte, mediado por el factor PPAR¿.
En conclusión, en esta Tesis se demuestra la capacidad nefroprotectora de la LC en ratas con HTA, describiéndose los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antifibróticos de la LC en estos animales. Además, ponemos en evidencia la mediación del factor de transcripción PPAR¿ en los efectos antifibróticos de la LC.
