Resumen de Riesgos tóxicos por cianotoxinas en peces de consumo: optimización de métodos de análisis, potenciales mecanismos de toxicidad y tratamiento
Las cianobacterias han ido adquiriendo gran importancia a lo largo de los años debido a su capacidad de formar floraciones o ¿blooms¿, las cuales pueden llegar a ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, por lo que se han convertido en una preocupación a nivel mundial en materia de contaminación ambiental, toxicológica, sanitaria y económica, ya que pueden afectar tanto a animales y plantas como a seres humanos. De todas las cianotoxinas, y dado que son las únicas que han causado fenómenos masivos de intoxicación en poblaciones humanas, merecen especial atención las Microcistinas (MCs) y la Cilindrospermopsina (CYN), constituyendo esta última el principal objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral. Por todo ello, decidimos realizar una serie de estudios para investigar, en primer lugar, los efectos que pueden tener diferentes técnicas usuales de cocinado en las concentraciones de MCs en el pescado contaminado destinado al consumo humano. En el caso de la CYN, en primer lugar, nos pareció importante la puesta a punto y validación de métodos analíticos para cuantificar la toxina en diferentes matrices, y posteriormente decidimos profundizar en su mecanismo de toxicidad y sus efectos tóxicos, así como estudiar alternativas que nos permitieran contrarrestar los daños producidos por dicha toxina. Asimismo, también estudiamos su distribución en tejidos de peces contaminados. Todo ello en una de las especies acuáticas de consumo humano que pueden verse afectadas por esta toxina en su hábitat natural, como es el pez tilapia (Oreochromis niloticus). Por otra parte, también se ha abordado, mediante proteómica, el estudio del repertorio de Glutatión-S-transferasas (GSTs) en branquias de bivalvos, y los efectos de la CYN sobre plantas de consumo humano, como son las zanahorias (Daucus carota), expuestas a la toxina mediante el agua de riego.
Una de las vías de exposición a MCs más importantes es la vía oral. Además, las MCs pueden bioacumularse en organismos acuáticos, pudiendo ser transferidas a lo largo de la cadena trófica hasta los escalones más altos, y llegando así a los seres humanos, por lo que el consumo de estos animales acuáticos contaminados representa un riesgo potencial para la salud humana. Así, una correcta evaluación de riesgos de la exposición humana a MCs a través de los alimentos requiere de un detallado conocimiento acerca de la influencia del procesado y cocinado del alimento sobre estas toxinas. Es por ello que nos propusimos investigar los posibles cambios en la concentración de MCs libres en músculo de tilapias (Oreochromis niloticus) (porción comestible) a las que se les añadió una mezcla de MCs puras (MC-LR, MC-RR y MC-YR), conteniendo 1,5 µg/mL de cada toxina, y sometidas posteriormente a dos técnicas de cocinado habituales, como son el horno microondas y el hervido en dos modalidades. Se ha comprobado que ambas técnicas de cocinado son capaces de reducir los niveles de MCs libres en el pescado (Oreochromis niloticus) en un rango entre 25-50%, siendo mayor con el hervido continuo en el caso de la MC-RR. Concretamente, el hervido continuo ha demostrado ser el más eficaz, debido tal vez al mayor tiempo de permanencia de la muestra en el agua. Asimismo, tras detectar MCs en el agua de hervido, mostramos que existe un riesgo adicional inherente a la utilización de esta agua para hacer sopas de pescado. En general, estas técnicas podrían ser consideradas como medidas de control de estas toxinas en la dieta tras el consumo humano de los alimentos cocinados. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: EFFECTS OF THERMAL TREATMENTS DURING COOKING, MICROWAVE OVEN AND BOILING, ON THE UNCONJUGATED MICROCYSTIN CONCENTRATION IN MUSCLE OF FISH (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2011. Food and Chemical Toxicology 49, 2060-2067).
La monitorización de CYN en medios contaminados por cianobacterias es de gran importancia para evaluar los riesgos que supone su exposición para la salud y el medioambiente. Las técnicas analíticas empleadas para detectar y cuantificar esta toxina, tanto en aguas como en otras matrices, son de diverso fundamento y complejidad (ELISA, LC-DAD, LC-MS y LC-MS/MS). Sin embargo, no todos estos métodos ofrecen la misma sensibilidad. La LC-MS/MS ha sido elegida como el método ideal y de referencia para detectar y cuantificar pequeñas cantidades de toxina en muestras de agua (Eaglesham y col., 1999; Bogialli y col., 2006; Oehrle y col., 2010) y en muestras más complejas, como tejidos de peces (Gallo y col., 2009) o muestras de suero y orina humanas (Foss y Aubel, 2013). Por ello nos propusimos poner a punto y validar diferentes métodos cuantitativos, incluyendo ensayos de robustez, para la determinación de CYN en distintas matrices (aguas, cultivos de cianobacterias y tejidos de peces contaminados con CYN) por LC-MS/MS. Con el empleo de cartuchos de carbón grafitizado se obtuvieron resultados fiables en la extracción de CYN a partir de aguas y de cultivos de cianobacterias, usando una mezcla acidificada de diclorometano:metanol como disolvente. En el caso de los tejidos de peces (hígado y músculo), mediante un sistema SPE de doble cartucho (uno de C18 y uno de carbón grafitizado) conseguimos extractos limpios que permitieron la recuperación de la toxina en un alto porcentaje (80-110%). Por tanto, los métodos que proponemos han sido adecuadamente validados: con amplios rangos de concentraciones de CYN, límites de detección y cuantificación aceptables (que en el caso del agua, permiten la determinación de la toxina por debajo del valor guía propuesto por la OMS de 1 µg/L), recuperaciones en el intervalo 80-110%, y valores adecuados de precisión según la guía AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Asimismo, la combinación de factores variables en la metodología demostró la robustez de los métodos propuestos para poder ser reproducidos bajo diferentes condiciones sin sufrir variaciones significativas en los resultados. Los métodos desarrollados en esta Tesis Doctoral pudieron ser aplicados con éxito y rapidez posteriormente para el análisis de CYN en las diferentes matrices estudiadas (aguas y matrices biológicas), permitiendo un control de la exposición, degradación, transferencia y bioacumulación de la CYN. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: CYLINDROSPERMOPSIN DETERMINATION IN WATER BY LC-MS/MS: OPTIMIZATION AND VALIDATION OF THE METHOD AND APPLICATION TO REAL SAMPLES. (Guzmán-Guillén y col., 2012. Environmental Toxicology and Chemistry 31 (10), 2233-2238).
DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF A METHOD FOR THE DETERMINATION OF CYLINDROSPERMOPSIN FROM STRAINS OF APHANIZOMENON CULTURES: INTRA-LABORATORY ASSESSMENT OF ITS ACCURACY BY USING VALIDATION STANDARDS. (Guzmán-Guillén y col., 2012. Talanta 100, 356-363).
CYN DETERMINATION IN TISSUES FROM FRESHWATER FISH BY LC-MS/MS: VALIDATION AND APPLICATION IN TISSUES FROM SUBCHRONICALLY EXPOSED TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2015. Talanta 131, 452-459).
Debido a que la CYN es una toxina emergente, su mecanismo de acción tóxica en las distintas especies acuáticas es menos conocido que el de las MCs. Nos propusimos entonces profundizar en el conocimiento del papel que juega el estrés oxidativo en el mecanismo de toxicidad de la CYN, investigando el efecto de diversas variables experimentales como son las dosis administradas (10 y 100 µg CYN/L) y el tiempo de exposición (7 y 14 días) sobre la alteración de biomarcadores de estrés oxidativo en hígado y riñón de peces de consumo humano (O. niloticus) expuestos a CYN por inmersión en aguas con un liofilizado de células de A. ovalisporum con 10 y 100 µg CYN/L, y 0,46 y 4,6 µg 7-desoxi-CYN/L, respectivamente. Nuestros resultados demuestran la implicación del estrés oxidativo como un mecanismo de acción tóxica de la CYN, manifestado por alteraciones en los niveles de LPO, oxidación de proteínas y del ADN, la relación GSH/GSSG, y cambios en las actividades de GST, GPx, SOD, CAT, y ¿-GCS. Además, se observaron en general cambios más significativos con la concentración más alta y durante el mayor período de exposición, lo que muestra una toxicidad dependiente de la concentración y del tiempo de exposición. Además, el riñón se mostró como el principal órgano afectado por la exposición a CYN. Demostrada la alteración de parámetros bioquímicos de estrés oxidativo, nos propusimos estudiar las alteraciones histopatológicas producidas en tilapias bajo las mismas condiciones experimentales. Esta relación dosis y tiempo-dependiente mostrada anteriormente se confirma con las alteraciones histopatológicas observadas en el hígado, riñón, corazón, tracto gastrointestinal (G.I.) y branquias de tilapias expuestas durante 7 ó 14 días a 10 ó 100 µg CYN/L. Los resultados de estas investigaciones se reflejan en las siguientes publicaciones: CYANOBACTERIUM PRODUCING CYLINDROSPERMOPSIN CAUSES OXIDATIVE STRESS AT ENVIRONMENTALLY RELEVANT CONCENTRATIONS IN SUB-CHRONICALLY EXPOSED TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2013. Chemosphere 90, 1184-1194).
CYANOBACTERIUM PRODUCING CYLINDROSPERMOPSIN CAUSES HISTOPATHOLOGICAL CHANGES AT ENVIRONMENTALLY RELEVANT CONCENTRATIONS IN SUBCHRONICALLY EXPOSED TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2013. Environmental Toxicology (in press). DOI: 10.1002/tox.21904).
Una vez demostrado el papel del estrés oxidativo como mecanismo de acción tóxica de la CYN, así como las alteraciones histopatológicas producidas en varios órganos de tilapia, nos preguntamos si esta toxina también sería capaz de inducir alteraciones neurológicas en esta especie, basándonos en algunos estudios previos realizados en mamíferos y animales acuáticos expuestos a CYN (Kiss y col., 2002; Schoeb y col., 2002; Zagatto y col., 2012). Nuestros resultados muestran por primera vez los efectos neurotóxicos de la CYN en peces, con disminución del 35% en la actividad de la acetilcolinesterasa (AChE), aumento del 71% en los niveles de LPO y alteraciones histopatológicas en el cerebro de tilapias expuestas a dosis repetidas de CYN por inmersión en un cultivo de A. ovalisporum durante 14 días. Además, la toxina fue detectada en el 100% de los cerebros de peces expuestos a la toxina. Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente publicación: CYLINDROSPERMOPSIN INDUCES NEUROTOXICITY IN TILAPIA FISH (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO APHANIZOMENON OVALISPORUM. (Guzmán-Guillén y col., 2015. Aceptado en Aquatic Toxicology).
Tras comprobar los efectos tóxicos producidos por la CYN en nuestro modelo experimental bajo las condiciones de ensayo expuestas, nos preguntamos sobre la efectividad del uso de algunos antioxidantes como suplementos en la dieta, como la L-carnitina (LC) y la vitamina E, para prevenir la aparición de estos efectos. En primer lugar, se comprobó que la LC, administrada como pretratamiento de 21 días, ejerce un efecto protector a partir de la menor dosis utilizada (400 mg LC/kg p.c./día) frente al daño oxidativo producido por la exposición aguda a 400 µg CYN/kg p.c., tanto pura como liofilizada, al prevenir la alteración de los niveles de biomarcadores de estrés oxidativo ya mencionados. Asimismo, también demostramos la utilidad de la LC para prevenir las alteraciones histopatológicas en hígado, riñón, corazón, tracto G.I. y branquias de peces intoxicados con CYN. Al mismo tiempo, nos planteamos investigar la efectividad de este antioxidante para aliviar o mejorar las variaciones en la expresión génica de las enzimas GPx y GST, así como la abundancia relativa de GST en hígado y riñón bajo las mismas condiciones, ya que estos marcadores pueden proporcionar una información temprana sobre el estado del pez. Los resultados preliminares mostraron que la LC consiguió restaurar a valores control los niveles de actividad GPx en hígado y GST en riñón de los peces expuestos a CYN. Asimismo, se observó un aumento de la expresión génica de GPx y GST en hígado de los peces suplementados con la dosis menor de LC (400 mg LC/kg) e intoxicados con CYN.
Asimismo, demostramos el uso de la vitamina E (pretratamiento de 7 días con 700 mg vitamina E/kg pez/día) como un quimioprotector seguro para la profilaxis de intoxicaciones de tilapias por CYN, mediante la restauración de los valores de biomarcadores oxidativos, así como la prevención de lesiones histopatológicas inducidas por CYN pura en el hígado, riñón, corazón, tracto G.I., branquias y cerebro de los peces expuestos. Todo ello ha tenido como resultado las publicaciones siguientes, y seguimos preparando otras publicaciones: THE PROTECTIVE ROLE OF L-CARNITINE AGAINST CYLINDROSPERMOPSIN-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2013. Aquatic Toxicology 132-133, 141-150).
L-CARNITINE (LC) PRETREATMENT PREVENTS HISTOPATHOLOGICAL CHANGES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO CYLINDROSPERMOPSIN. (Guzmán-Guillén y col., 2015. Pendiente de envío).
PROTECTIVE ROLE OF DIETARY L-CARNITINE ON ACTIVITY AND TRANSCRIPTION OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO CYLINDROSPERMOPSIN. (Guzmán-Guillén y col., 2015. Pendiente de envío).
BENEFICIAL EFFECTS OF VITAMIN E SUPPLEMENTATION AGAINST THE OXIDATIVE STRESS ON CYLINDROSPERMOPSIN-EXPOSED TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS). (Guzmán-Guillén y col., 2015. Pendiente de envío).
VITAMIN E PRETREATMENT PREVENTS HISTOPATHOLOGICAL EFFECTS IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) ACUTELY EXPOSED TO CYLINDROSPERMOPSIN. (Guzmán-Guillén y col., 2015. Pendiente de envío).
Y ha dado lugar a las siguientes solicitudes de patentes: USO DE L-CARNITINA PARA PROTEGER A LOS PECES DE LA INTOXICACIÓN POR CILINDROSPERMOPSINA. PATENTE. (Cameán y col., 2012).
USO DE VITAMINA E PARA PROTEGER A LOS PECES DE LA INTOXICACIÓN POR CILINDROSPERMOPSINA. PATENTE. (Cameán y col., 2014).
Posteriormente nos pareció interesante estudiar la posible reversión de los efectos tóxicos producidos por CYN tras transferir a los peces a un medio no contaminado, para su depuración. Los resultados mostraron que cortos periodos de depuración (3 ó 7 días) podrían ser efectivos para restaurar hasta los niveles basales algunos marcadores de estrés oxidativo (LPO, oxidación de proteínas y del ADN, actividades SOD, CAT y ¿-GCS, y la relación GSH/GSSG), en hígado y riñón de tilapias expuestas a células de A. ovalisporum que contienen CYN y 7-desoxi-CYN durante 7 y 14 días. Asimismo, la depuración demostró la mejora de las alteraciones a nivel neurológico (actividad AChE, niveles de LPO, efectos histopatológicos y presencia de CYN en cerebro) en las mismas condiciones, sugiriendo que este puede ser un proceso de destoxicación efectiva en peces potencialmente expuestos a CYN. Los resultados han quedado patentes en la siguiente publicación: EFFECTS OF DEPURATION ON OXIDATIVE BIOMARKERS IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) AFTER SUBCHRONIC EXPOSURE TO CYANOBACTERIUM PRODUCING CYLINDROSPERMOPSIN. (Guzmán-Guillén y col., 2014. Aquatic Toxicology 149, 40-49).
Por otra parte, consideramos de interés evaluar la distribución de la CYN en tejidos de peces contaminados, mediante inmunohistoquímica (IHC). Los resultados demostraron que el órgano que presentó mayor tinción fue el hígado, seguido por el riñón, el intestino y las branquias de tilapias expuestas a CYN. Además, la señal se intensificó con el aumento del tiempo tanto en el ensayo agudo como en el subcrónico, confirmando la toxicidad retardada de CYN, y también con el aumento de la dosis, como se muestra en el ensayo subcrónico. Las señales en el intestino y las branquias fueron más intensas en el ensayo subcrónico, debido a que los peces están continuamente sumergidos en el agua que contiene la toxina. Por lo tanto, se demuestra la utilidad de la IHC para estudiar la distribución de la CYN en estos organismos. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: IMMUNOHISTOCHEMICAL APPROACH TO STUDY CYLINDROSPERMOPSIN DISTRIBUTION IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) UNDER DIFFERENT EXPOSURE CONDITIONS. (Guzmán-Guillén y col., 2014. Toxins 6, 283-303).
Para la realización de esta Tesis Doctoral, la doctoranda realizó tres estancias de investigación en el Centro Interdisciplinar de Investigación Marina y Ambiental (CIIMAR) de la Universidad de Oporto, bajo la dirección del Dr. Vitor Vasconcelos (de Septiembre a Diciembre del 2012, de Agosto a Octubre del 2013, y de Junio a Agosto del 2014), en la que se abordaron varios objetivos.
Profundizamos en la diversidad proteica de las Glutatión-S-transferasas (GSTs), caracterizando el conjunto de sus isoformas presentes en las branquias del mejillón marino Mytilus galloprovincialis, mediante técnicas proteómicas. Los resultados preliminares muestran una eficiente extracción, purificación y separación de varias isoformas de GST mediante electroforesis bidimensional (2D), y su identificación por MALDI-TOF/TOF, constituyendo la primera caracterización de la familia de GSTs en este órgano.
Por último, por ser escasos los estudios que relacionan a la CYN con plantas, se consideró interesante el estudio del efecto de la CYN sobre organismos vegetales destinados al consumo humano, ya que ésta puede encontrarse en los reservorios de aguas destinadas al riego, y por tanto pasar a las plantas, constituyendo con ello un importante riesgo para la salud humana. Así, nos propusimos conocer los efectos de la CYN sobre las condiciones fisiológicas, capacidad fotosintética y valor nutritivo (contenido en minerales) de zanahorias (Daucus carota) expuestas a diferentes dosis de la toxina durante 30 días. Los resultados preliminares sugieren que son capaces de hacer frente a concentraciones ambientales de CYN (10 y 50 µg/L) contenida en extractos de A. ovalisporum, con un mantenimiento y aumento del peso fresco de las raíces, sin afectar negativamente la fotosíntesis, aunque sí se afectan procesos metabólicos tales como la acumulación de minerales.
