Déficit de factor V de la coagulación: Desarrollo de un modelo de enfermedad en ratón. Estudios in vitro e in vivo de terapia génica

• Autores: Juan Andrés de Pablo Moreno
• Directores de la Tesis: Antonio Liras Martín (dir. tes.), Mariano Andrés García Arranz (dir. tes.), Luis Revuelta Rueda (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2025
• Idioma: español
• Número de páginas: 295
• Títulos paralelos:
  • Coagulation factor V deficiency: development of a disease mouse model. In vitro and in vivo gene therapy studies
• Tribunal Calificador de la Tesis: Pedro Luis Lorenzo González (presid.), Natalia Guerra Pérez (secret.), Maria Garcia Bravo (voc.), Liliana Carmen Rossetti (voc.), Teresa María Alvarez Román (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología por la Universidad Complutense de Madrid
• Menciones:
  • Internacional
• Calificación: Sobresaliente Cum Laude
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Genética clínica
    • Patología
      • Hemopatología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    El déficit de factor V es una enfermedad ultra rara, hereditaria y recesiva, causada por mutaciones en el gen F5, que provocan una deficiencia o disfunción del factor V de la coagulación. Su presentación clínica varía desde asintomática hasta hemorragias graves, con síntomas como epistaxis, menorragia y sangrado oral. El tratamiento actual se basa en plasma fresco congelado, ofreciendo una mejora temporal sin prevenir futuros eventos hemorrágicos.

    El factor V es una proteína que actúa en la hemostasia secundaria junto con el factor X activado para transformar la protrombina en trombina. Es producido principalmente en hepatocitos (80%) y megacariocitos (20%), circulando en el plasma y almacenado en las plaquetas.

    Los modelos animales para el déficit de factor V que se han desarrollado previamente, se caracterizan por ser no viables, lo que significa que no son susceptibles de ensayo de procedimientos ni estudios de la enfermedad.

    La terapia génica ha demostrado un potencial creciente en el tratamiento de enfermedades hereditarias al ofrecer una corrección duradera de defectos genéticos mediante la introducción de genes funcionales en las células afectadas. En el caso de la terapia génica lentiviral, el uso de estos vectores permite una inserción estable del gen terapéutico en el genoma de las células diana, lo que facilita una producción sostenida de la proteína deficitaria.

    Ante la necesidad clínica de un tratamiento para el déficit de factor V, el presente trabajo de investigación se propuso como objetivo principal desarrollar una terapia génica basada en vectores lentivirales, pudiendo proporcionar una solución más duradera y efectiva para el tratamiento de esta enfermedad. Así, para evaluar la terapia génica, se planteó el objetivo específico de generar un modelo animal viable que permita el estudio del déficit de factor V y su tratamiento.

    Primero, se realizó una caracterización y normalización detallada de los parámetros coagulométricos (niveles de factor V, tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada) en Mus musculus. El objetivo fue suavizar las curvas de calibración, que a menudo presentan pendientes pronunciadas y rangos de medición estrechos entre cada punto de calibración.

    A continuación, se generó un modelo en ratón mediante la técnica CRISPR/Cas9, replicando la mutación humana Thr1898Met (equivalente a Thr1857Met en ratones), seleccionada por su fenotipo leve. Esta modificación permitió obtener animales homocigotos viables con niveles reducidos de factor V (24,48%) y tiempos de coagulación alterados pero compatibles con la vida.

    Validado el modelo, se desarrolló un transgén terapéutico diseñado para expresar un factor V funcional activado sin el dominio B. La prueba de principio de esta terapia génica reveló resultados positivos. Por un lado, se obtuvo una mejora significativa in vitro en células HepG2 deficientes en factor V en niveles de funcionalidad de la proteína con un ajuste de decaimiento bifásico al aumentar la dosis del vector. In vivo, se incrementó la actividad coagulante de los ratones homocigotos Thr1857Met y mejoró los tiempos de coagulación, respaldando el potencial de la terapia para prevenir episodios hemorrágicos. Estudios adicionales en tejidos confirmaron la integración hepática en animales tratados, con expresión de la proteína humana mediante Western blot y aumento de inmunoexpresión en factor V, trombina y ¿-actina de músculo liso.

    Los resultados obtenidos demuestran la viabilidad del modelo en ratón y la eficacia preliminar de la terapia génica propuesta. Además, esta estrategia podría aplicarse a otras coagulopatías hereditarias, ampliando las opciones terapéuticas en enfermedades raras. Esta Tesis Doctoral contribuye al avance de la medicina personalizada, posicionando la terapia génica lentiviral como una alternativa duradera frente a los tratamientos convencionales y con el potencial de mejorar significativamente la calidad de vida de los pacientes afectados.

  • English

    Factor V deficiency is an ultra-rare, hereditary, monogenic, and recessive disease caused by the presence of a wide heterogeneity of mutations in the F5 gene, characterized by a deficiency or dysfunction of coagulation factor V. Patients exhibit a clinical spectrum ranging from asymptomatic cases to severe bleeding, with common symptoms such as epistaxis, menorrhagia, and oral bleeding. Current therapies are limited to on-demand replacement during bleeding episodes using fresh frozen plasma, which provides temporary relief with out preventing future bleeding events. Factor V is a protein involved in secondary hemostasis, working alongside activated factor X to convert prothrombin into thrombin. It is mainly produced in hepatocytes (80%) and megakaryocytes (20%), circulating in plasma and stored in platelets. Its activation, primarily mediated by thrombin, removes the B domain, forming activated factor V, which is inactivated by activated protein C and phosphatidylserine, reducing its affinity for activated factor X. Additionally, factor V has anticoagulant properties, inactivating the tenase complex and enhancing the efficacy of tissue factor pathway inhibitor...