Resumen de Adaptación de Toxoplasma gondii durante el cultivo in vitro: Efecto en rasgos fenotípicos asociados a la virulencia
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Toxoplasma gondii es un parásito apicomplejo con un ciclo biológico heteroxeno donde los felinos actúan como hospedadores definitivos y una amplia variedad de vertebrados homeotermos, mamíferos y aves, incluido el ser humano, como intermediarios. Este patógeno zoonósico tiene tres estadios infectantes: i) el esporozoíto, incluido en el ooquiste que es una forma de resistencia excretada al ambiente tras la replicación sexual en el hospedador definitivo; ii) el taquizoíto, estadio de multiplicación rápida que se disemina en los tejidos del hospedador intermediario durante la fase aguda de la infección; y iii) el bradizoíto o estadio de multiplicación lenta albergado en el interior de quistes en tejidos inmunoprivilegiados del hospedador intermediario durante la fase crónica de la infección. La primoinfección en mujeres embarazadas puede dar lugar a la transmisión congénita con consecuencias graves en el feto y el neonato, como encefalomielitis o hidrocefalia, y la reactivación de la toxoplasmosis en humanos inmunodeprimidos puede causar encefalitis, que podría ser fatal, miocarditis y/o neumonitis. En los pequeños rumiantes la toxoplasmosis se asocia principalmente al fallo reproductivo con importantes pérdidas económicas.
Muchos estudios han empleado aislados de T. gondii mantenidos en el laboratorio durante periodos de tiempo prolongados, habiéndose detectado modificaciones significativas en su fenotipo como la capacidad de generación de ooquistes, su virulencia y la capacidad de formación espontánea de bradizoítos in vitro. La transición de taquizoíto a bradizoíto requiere adaptaciones morfológicas y metabólicas, reguladas por mecanismos transcripcionales y epigenéticos, en los cuales el estrés inmunológico parece jugar un papel clave y, aunque en el laboratorio la formación de quistes se vincula a su crecimiento en condiciones de estrés, muchos aislados recién obtenidos dan lugar a la formación espontánea de quistes.
Hasta el momento, los mecanismos de adaptación in vitro de T. gondii se han investigado poco. Por ello, el objetivo de esta tesis doctoral fue estudiar el efecto del mantenimiento en cultivo a corto plazo de diversos aislados tipo II y tipo III de T. gondii sobre parámetros fenotípicos básicos asociados con la virulencia. En concreto, se han puesto en evidencia cambios significativos en la capacidad de transformación espontánea de taquizoíto a bradizoíto y de formar quistes, en su proliferación in vitro y en la virulencia en un modelo murino armonizado. Los aislados tipo II de origen ovino [TgShSp1 (genotipo ToxoDB #3), TgShSp2 (#1), TgShSp3 (#3) y TgShSp16 (#3)] y tipo III (#2) [TgShSp24 y porcino TgPigSp1], tras 25-30 pases de mantenimiento in vitro mostraron un acortamiento en la duración de su ciclo lítico que se acompañó de cambios en su virulencia -exacerbación o atenuación- en el ratón. Comparativamente se observó mayor morbilidad (TgShSp2 y TgShSp3), y mortalidad (TgShSp24 y TgPigSp1) en el pase 50. Sin embargo, TgShSp16 presentó atenuación con ausencia de mortalidad y signos graves, y la infección con TgShSp1 cursó sin diferencias en los parámetros de morbilidad y mortalidad entre el p10 vs. p50. También los aislados de T. gondii tipo II y III mostraron una capacidad, dependiente del aislado, para la formación espontánea de quistes in vitro, sin necesidad de exponerse a estrés. Este comportamiento parece priorizar la formación de quistes en tejidos del hospedador asegurando su transmisión a otros hospedadores por carnivorismo. No obstante, tras sucesivos pases in vitro, se pierde esta capacidad y se favorece el estadio de taquizoíto. Esta adaptación al entorno de laboratorio sugiere la existencia de un estadio de taquizoíto "pro-bradizoíto" en aislados recientemente obtenidos tipo II y tipo III que favorece la formación de quistes. Los resultados obtenidos plantean limitaciones al uso de aislados adaptados al laboratorio para el estudio de la biología del parásito y de la enfermedad que origina.
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Over the years numerous studies have used Toxoplasma gondii isolates and strains maintained in the laboratory for long periods of time. However, there is evidence that such long-term maintenance can lead to significant changes in the phenotypic characteristics of the parasite, including virulence, which may mask the results obtained (Lindsay et al., 1991; Buxton & Innes, 1995; Dubey et al., 1999). The mechanisms involved in this adaptation are poorly understood, and it is therefore of interest to investigate them further.The overall aim of this doctoral thesis was to study the effect of short-term cell culture adaptation on newly obtained T. gondii isolates of type II and III, focusing on two key aspects of their biology: cyst-forming and proliferative capacities, as well as the effects on virulence in a harmonised mouse model.For this purpose, the isolates used were from: (i) aborted sheep foetal brain (type II-PRU - TgShSp1 and TgShSp3 - ToxoDB genotype #3 on the one hand, and type II - TgShSp2 (#1) on the other); (ii) adult sheep myocardium (type II-PRU - TgShSp16 (#3) and type III - TgShSp24 (#2)); and (iii) adult pig myocardium type III - TgPigSp1 (#2). This panel of isolates was selected for their representation of types II and III, based on: (a) predominance of these genotypes in the European population, (b) their virulence profile as determined in previous studies, and (c) knowledge of the history of maintenance in cell culture since isolation (Fernández-Escobar et al., 2020a, 2020b, 2021)...
