Dominios funcionales en la proteína terminal del bacterlófago ²29
- Autores: Ángel Zaballos Sanz
- Directores de la Tesis: Margarita Salas Falgueras (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 1990
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco García Olmedo (presid.), José María Almendral del Río (secret.), Juan Ortin (voc.), Manuel Espinosa Urgel (voc.), Miguel Hermoso Jose (voc.)
- Materias:
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- Resumen
LA INICIACION DE LA REPLICACION EN DNAS LINEALES CON PROTEINAS UNIDAS COVALENTEMENTE A LOS EXTREMOS DEL GENOMA TIENE LUGAR MEDIANTE LA FORMACION DE UN COMPLEJO COVALENTE ENTRE UNA PROTEINA TERMINAL LIBRE Y EL PRIMER NUCLEOTIDO EN POSICION 5' DE LOS EXTREMOS DEL DNA, QUE SON LOS ORIGENES DE REPLICACION. EN EL BACTERIOFAGO 029 DE BACILLUS SUBTILIS SE HA DEMOSTRADO QUE LA FORMACION DEL COMPLEJO DE INICIACION ES CATALIZADA POR LA DNA POLIMERASA VIRAL, QUE A SU VEZ UTILIZA EL EXTREMO NUCLEOTIDICO 3' OH COMO SUSTRATO DE POLIMERIZACION EN EL PROCESO DE ELONGACION. SE HA PROPUESTO QUE, COMO PASOS PREVIOS A LA CATALISIS, DEBERIA OCURRIR LA ASOCIACION FISICA DE AMBAS PROTEINAS Y POSTERIORMENTE EL RECONOCIMIENTO POR ESTE COMPLEJO DE LOS ORIGENES DE REPLICACION, A TRAVES DE INTERACCIONES CON LA PROTEINA TERMINAL UNIDA AL DNA Y/O CON EL DNA DEL ORIGEN.
LA PROTEINA TERMINAL DE 029 INTERACCIONA IN VITRO TANTO CON LA DNA POLIMERASA COMO CON EL DNA. CON EL FIN DE DETERMINAR SI ESTAS INTERACCIONES SON ESTRICTAMENTE REQUERIDAS PARA EL PROCESO DE INICIACION DE LA REPLICACION SE HAN GENERADO, MEDIANTE MANIPULACIONES GENICAS IN VITRO MUTANTES DE DELECION EN AMBOS EXTREMOS DE LA PROTEINA TERMINAL, ASI COMO MUTANTES CON DELECIONES INTERNAS EN SU MITAD AMINO TERMINAL. PARA OBTENER LAS PROTEINAS MUTANTES EN ESCHERICHIA COLI SE HAN CONSTRUIDO PLASMIDOS DE EXPRESION QUE PERMITEN PRODUCIR CUALQUIER FASE DE LECTURA ABIERTA.
LAS PROTEINAS EXPRESADAS EN E.COLI SE HAN PURIFICADO A PARTIR DE FRACCIONES INSOLUBLES POR EXTRACCION CON CLORURO DE GUANIDINA, RENATURALIZACION MEDIANTE DIALISIS Y UN PASO DE CROMATOGRAFIA EN FOSFOCELULOSA. SE HAN ENSAYADO SUS PROPIEDADES, OBTENIENDOSE UNA PERFECTA CORRELACION ENTRE LA FUNCION INICIADORA DE LA PROTEINA Y SU INTERACCION CON LA DNA POLIMERASA Y EL DNA, DEMOSTRANDOSE QUE AMBAS INTERACCIONES SON NECESARIAS PARA QUE LA INICIACION TENGA LUGAR.
