Caracterización y resistencia a antimicrobianos de aislados españoles de "Glaesserella parasuis". Valoración de la eficacia de una vacuna frente a la enfermedad de Glässer basada en una TbpB (proteína de unión a la transferrina) modificada

• Autores: Alba González Fernández
• Directores de la Tesis: Sonia Martínez Martínez (dir. tes.), María José García Iglesias (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2025
• Idioma: español
• Número de páginas: 120
• Títulos paralelos:
  • Characterization and antimicrobial resistance of Spanish isolates of "Glaesserella parasuis". Evaluation of the efficacy of a vaccine against Glässer's disease based on a modified TbpB (transferrin-binding protein)
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Salinas Lorente (presid.), Ana María Balseiro Morales (secret.), Azucena Mora Gutiérrez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias y de los Alimentos por la Universidad de León
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: BULERIA
• Resumen
  • español

    La industria porcina enfrenta importantes desafíos económicos, siendo la enfermedad de Glässer uno de los más relevantes. Esta enfermedad está causada por Glaesserella (Haemophilus) parasuis, patógeno que coloniza el tracto respiratorio superior de los cerdos y, en condiciones de estrés como el destete o el transporte, puede desencadenar infecciones sistémicas graves. Los lechones en las primeras etapas de lactancia y engorde son especialmente vulnerables, lo que genera altos índices de morbilidad y mortalidad. Esta bacteria adquiere hierro de la transferrina porcina mediante un receptor de superficie compuesto por las proteínas de unión a la transferrina TbpA y TbpB, lo que facilita su supervivencia en entornos con baja disponibilidad de hierro, como las superficies mucosas. Sin embargo, los mecanismos de virulencia de esta bacteria aún no se comprenden completamente y el desafío se agrava por el preocupante aumento de la resistencia a los antimicrobianos, impulsado por su uso intensivo en la producción porcina. Este doble problema pone de manifiesto la urgencia de profundizar en la investigación sobre los factores de patogenicidad de G. parasuis y de desarrollar estrategias que permitan reducir el uso de estos medicamentos sin comprometer el control de la enfermedad. Este fenómeno compromete la efectividad de los tratamientos y plantea un riesgo adicional de transmisión de genes de resistencia a otras bacterias en el entorno. Sin embargo, ante la ausencia de una vacuna universal comercialmente disponible para prevenir esta enfermedad, el tratamiento con antimicrobianos sigue siendo la principal estrategia de control, a pesar de los desafíos asociados. Esto subraya la necesidad de desarrollar herramientas de diagnóstico precisas, fomentar un uso responsable de los antimicrobianos y promover investigaciones que permitan avances en el diseño de vacunas eficaces y de amplio espectro. El objetivo principal de esta tesis doctoral es realizar una caracterización detallada de la virulencia y los perfiles de resistencia a antimicrobianos de aislados de G. parasuis presentes en explotaciones porcinas españolas. Paralelamente, se busca analizar la diversidad genética de la proteína TbpB en estos aislados, con el propósito de evaluar la eficacia de una vacuna recombinante basada en TbpB frente a una variedad de serovares clínicos representativos de la enfermedad de Glässer en España. En primer lugar, se analizaron 68 aislados clínicos de G. parasuis recolectados entre 2018 y 2021 en diversas regiones de España, provenientes de muestras respiratorias y sistémicas de cerdos. Para su caracterización, se utilizó una PCR específica del gen tbpA y una PCR multiplex para identificar los serovares presentes. Los serovares 5, 10, 2, 4 y 1 resultaron ser los más comunes, abarcando aproximadamente el 84 % de los aislados, lo que pone de manifiesto su alta prevalencia en el país. A continuación, se llevó a cabo un análisis de las secuencias de aminoácidos de la proteína TbpB en 59 de estos aislados, que permitió clasificar las cepas en diez clados distintos. Este hallazgo refleja una notable diversidad genética entre las cepas, que se relaciona tanto con los tipos capsulares como con los diferentes orígenes anatómicos y geográficos de los aislamientos. Con el fin de caracterizar la virulencia de los aislados, se evaluó la virulencia mediante PCR multiplex de secuencia líder de los genes vtaA, y todos los aislados se identificaron como clínicos (presuntamente virulentos). El patotipado basado en diez genes del pangenoma reveló que el gen virulento HPS_22970 era el más frecuente (83,1%). Se observaron diversos perfiles de patotipo, con 29 combinaciones génicas únicas y dos aislados portadores únicamente de genes del pangenoma potencialmente no virulentos. Posteriormente, se analizaron los perfiles de resistencia a antimicrobianos de los aislados, obteniendo una resistencia generalizada en el fenotipado de resistencias antimicrobianas, con un 63,3% clasificado como multirresistente, y una alta resistencia a la clindamicina (98,3%) y la tilosina (93,3%). Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre ciertos genes de patotipos y fenotipos de resistencia a antimicrobianos, en particular entre el gen virulento HPS_22970 y la resistencia a la tetraciclina (p < 0,001). Por último, en este estudio se evaluó en dos fases la inmunogenicidad y protección de una vacuna oral de dos dosis, basada en una TbpB modificada (TbpBY167A) en lechones privados de calostro. En la primera fase (días 0-45), se analizó la respuesta inmunitaria, y en la segunda (días 45-52), la protección heteróloga tras desafiar a los lechones con cuatro aislados clínicos de G. parasuis de diferentes serovares. La vacuna indujo una respuesta inmune robusta, con un aumento significativo de IgA e IgM. Tras el desafío, se observó una mejora en las tasas de supervivencia y una reducción en los signos clínicos y las lesiones, independientemente del serovar. Además, la vacuna redujo la colonización en el tracto respiratorio y en tejidos sistémicos, como las articulaciones, el hígado y el cerebro. El análisis inmunohistoquímico reveló un menor número de macrófagos en los pulmones de los lechones inmunizados. Los hallazgos de este estudio destacan la variabilidad genética de G. parasuis y su compleja patogenicidad, evidenciando la necesidad de caracterizar de manera precisa los aislados clínicos para asegurar tratamientos antimicrobianos adecuados y medidas profilácticas efectivas contra las cepas virulentas. A pesar de la diversidad genética observada en los serovares, los hallazgos in silico sugieren que una vacuna basada en la proteína TbpB podría ofrecer una protección amplia contra los brotes de la enfermedad de Glässer en España, destacando su potencial como herramienta de control en la industria porcina. En cuanto al estudio in vivo, la administración oral de la vacuna de subunidad TbpBY167A en lechones ha demostrado ser eficaz, brindando protección heteróloga frente a diferentes aislados virulentos, reduciendo significativamente la colonización bacteriana y la diseminación en los tejidos. Este enfoque supera las limitaciones de las vacunas tradicionales al contrarrestar los efectos de la inmunidad materna, convirtiéndola en una alternativa prometedora para la vacunación universal contra la enfermedad de Glässer.

  • English

    The swine industry faces significant economic challenges, with Glässer's disease being one of the most relevant. This disease is caused by Glaesserella (Haemophilus) parasuis, a pathogen that colonizes the upper respiratory tract of pigs and, under stressful conditions such as weaning or transportation, can trigger severe systemic infections. In addition, this bacterium is one of the secondary pathogens included in the Porcine Respiratory Disease Complex. Piglets in the early stages of lactation and fattening are particularly vulnerable, leading to high morbidity and mortality rates. This bacterium acquires iron from porcine transferrin through a surface receptor composed of the transferrin-binding proteins TbpA and TbpB, facilitating its survival in iron-limited environments, such as mucosal surfaces. However, the virulence mechanisms of this bacterium are not yet fully understood, and the challenge is further exacerbated by the concerning rise in antimicrobial resistance, driven by its intensive use in pig production. This dual issue highlights the urgent need to deepen research into the pathogenic factors of G. parasuis and to develop strategies that reduce the use of these drugs without compromising disease control. This phenomenon undermines the effectiveness of treatments and poses an additional risk of resistance gene transmission to other bacteria in the environment. Nonetheless, in the absence of a commercially available universal vaccine to prevent this disease, antimicrobial treatment remains the primary control strategy despite the associated challenges. This underscores the necessity to develop accurate diagnostic tools, promote responsible antimicrobial use, and encourage research to advance the design of effective, broad-spectrum vaccines. The main objective of this doctoral thesis is to provide a detailed characterization of the virulence and antimicrobial resistance profiles of G. parasuis isolates from Spanish pig farms. In parallel, the genetic diversity of the TbpB protein in these isolates will be analyzed, with the aim of evaluating the effectiveness of a recombinant TbpB-based vaccine against a variety of clinical serovars representative of Glässer's disease in Spain. First, 68 clinical G. parasuis isolates collected between 2018 and 2021 from various regions of Spain were analyzed. These isolates were obtained from respiratory and systemic samples from pigs. For their characterization, a species-specific PCR targeting the tbpA gene and a multiplex PCR assay were used to identify the present serovars. Serovars 5, 10, 2, 4, and 1 were found to be the most prevalent, accounting for approximately 84% of the isolates, highlighting their high prevalence across the country. An analysis of the amino acid sequences of the TbpB protein in 59 of these isolates was subsequently conducted, allowing for the classification of the strains into ten distinct clades. This finding reflects significant genetic diversity among the strains, which is associated with both capsular types and the various anatomical and geographical origins of the isolates. To characterize the virulence of the isolates, virulence was assessed using multiplex PCR with leader sequence targeting the vtaA genes, and all isolates were identified as clinical (presumed virulent). Pangenome-based pathotyping revealed that the virulent gene HPS_22970 was the most frequent (83.1%). Various pathotype profiles were observed, with 29 unique gene combinations and two isolates carrying only potentially non-virulent pangenome genes. Subsequently, the antimicrobial resistance profiles of the isolates were analyzed, revealing widespread resistance in the antimicrobial resistance phenotyping, with 63.3% classified as multi-resistant, and high resistance to clindamycin (98.3%) and tylosin (93.3%). A statistically significant association was found between certain pathotype genes and antimicrobial resistance phenotypes, particularly between the virulent gene HPS_22970 and tetracycline resistance (p < 0.001). Finally, this study assessed in two phases the immunogenicity and protection of a two-dose oral vaccine based on a modified TbpB (TbpBY167A) in colostrum-deprived piglets. In the first phase (days 0-45), the immune response was analyzed, and in the second phase (days 45-52), heterologous protection was evaluated after challenging the piglets with four clinical isolates of G. parasuis from different serovars. The vaccine induced a robust immune response, with a significant increase in IgA and IgM. Following the challenge, improved survival rates were observed, along with a reduction in clinical signs and lesions, regardless of the serovar. Additionally, the vaccine reduced colonization in the respiratory tract and in systemic tissues such as joints, liver, and brain. Immunohistochemical analysis revealed a lower number of macrophages in the lungs of immunized piglets. The findings of this study highlight the genetic variability of G. parasuis and its complex pathogenicity, underscoring the need for precise characterization of clinical isolates to ensure appropriate antimicrobial treatments and effective prophylactic measures against virulent strains. Despite the genetic diversity observed in the serovars, in silico findings suggest that a vaccine based on the TbpB protein could provide broad protection against outbreaks of Glässer’s disease in Spain, emphasizing its potential as a control tool in the swine industry. Regarding the in vivo study, the oral administration of the subunit vaccine TbpBY167A in piglets has proven effective, offering heterologous protection against different virulent isolates, significantly reducing bacterial colonization and dissemination in tissues. This approach overcomes the limitations of traditional vaccines by counteracting the effects of maternal immunity, making it a promising alternative for universal vaccination against Glässer’s disease.