Mecanismos moleculares de la incorporación de la histona centromérica CENP-A

• Autores: Patricia Sánchez Salomón
• Directores de la Tesis: Ana Losada Valiente (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2011
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ferran Azorín Marín (presid.), Juan Méndez Zunzunegui (secret.), Natalia Azpiazu Torres (voc.), Araceli G. Castillo (voc.), Marcos Malumbres (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: digitool-uam.greendata.es
• Resumen

  • El centrómero es una región de cromatina especializada sobre la que se ensambla el cinetocoro, una estructura multiproteica que actúa como punto de anclaje de los microtúbulos del huso mitótico. Los centrómeros están definidos epigenéticamente por la presencia de una variante de la histona H3, llamada Centromere Protein-A (CENP-A). Para compensar la dilución de los nucleosomas que llevan CENP-A en lugar de H3 durante la replicación del ADN, nuevos nucleosomas CENP-A se ensamblan en la cromatina del centrómero en cada ciclo de división celular. Los detalles mecanísticos de este proceso a nivel molecular aún se desconocen. El trabajo que se presenta en esta tesis se centra en el estudio de la regulación espacio-temporal de la incorporación de CENP-A. Para ello se han empleado dos modelos experimentales diferentes.

    Por una lado, se ha desarrollado un ensayo para medir la carga de CENP-A en cromosomas ensamblados a partir de extractos de huevos de Xenopus laevis. Por otro, se ha establecido una línea celular humana que expresa de forma inducible una versión marcada de CENP-A. En ambos casos la incorporación de CENP-A se ha seguido mediante técnicas de inmunofluorescencia.

    Nuestros resultados muestran que la incorporación de CENP-A en Xenopus ocurre al inicio de interfase de forma independiente a la replicación del ADN y requiere el paso previo por mitosis. La función de condensina II, un complejo implicado en la condensación cromosómica y que se acumula en la región centromérica, es necesaria tanto para la incorporación de nucleosomas CENP-A como para su retención durante interfase y mitosis.

    Asimismo hemos identificado y caracterizado el homólogo en Xenopus de HJURP, un factor necesario para la carga de CENP-A desde levaduras hasta humanos. XHJURP interacciona con la CENP-A soluble en el extracto pero no forma parte del nucleosoma centromérico final, lo que sugiere que este factor actúa como una chaperona clásica.

    En células humanas, GFP-CENPA se incorpora por toda la cromatina durante la fase S pero al inicio de la siguiente fase G1 se detecta su acumulación en los centrómeros. Esta acumulación requiere la función de un complejo que contiene Mis18!, Mis18" y M18BP1. Se ha sugerido que este complejo prepara la cromatina centromérica para la incorporación de CENP-A, y que para ello afecta el estado de acetilación de las histonas. Nosotros hemos observado que M18BP1 se asocia directamente a ARN centromérico y que su presencia en los centrómeros al final de mitosis es sensible al tratamiento con RNase A. Esto sugiere que la transcripción centromérica es importante para la formación/localización del complejo Mis18.

    Por otra parte, la reducción de los niveles celulares de Mis18 incrementa la presencia de histona H4 acetilada en la región centromérica. Mediante espectroscopía de masas hemos identificado nuevas proteínas asociadas a Mis18 que pueden ayudarnos a comprender la función y regulación de este complejo. Entre ellas destacan condensina II y BRG1, un factor remodelador de la cromatina de la familia SWI/SNF.