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Análisis estructural por RMN de las proteínas PCNA y GADD45alfa y sus interacciones implicadas en la reparación del ADN y el control del ciclo celular

  • Autores: Ricardo Sánchez Pérez
  • Directores de la Tesis: Francisco José Blanco Gutiérrez (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2009
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Jorge Santoro Said (presid.), Juan Méndez (secret.), Paz Sevilla Sierra (voc.), José M. Valpuesta (voc.), Víctor Calvo López (voc.)
  • Materias:
  • Resumen
    • El análisis estructural de dos proteínas implicada en la replicación y reparación del ADN, PCNA y Gadd45, se ha llevado a cabo en disolución por RMN y sus interacciones con otras proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular, como la quínasa Aurora A.

      PCNA es una proteína de 87 kDa (homotrímero de 261 aminoácidos) que dirige el progreso de la replicación y la reparación del ADN, reclutando multitud de proteínas que intervienen en estos procesos. Gadd45 es una proteína ácida de 18 kDa codificada por un gen inducible tras daño en el ADN y que interacciona con otras proteínas que intervienen en la reparación del ADN, el control del ciclo celular o la apoptosis. La asignación de las resonancias del esqueleto de PCNA humana ha sido posible gracias a la implementación de una metodología de estudio para proteínas de alto peso molecular por RMN, que incluye la producción de muestras etiquetadas 2H, 13C y 15N y el uso de la espectroscopia TROSY. Esta metodología se ha puesto a punto con PCNA de levadura y se ha aplicado a su homólogo humano. La asignación nos ha permitido estudiar por RMN la unión de fragmentos PIP de las proteínas Eco 1 (en levadura), p21WAF1 y p33lNG1, además de moléculas orgánicas de bajo peso molecular, identificados previamente de entre una librería de fragmentos como ligandos de PCNA, La unión de PCNA al fragmento PlP de p21 observada por RMN es consistente con la estructura cristalográfica del complejo donde el péptido se une al bucle interconector de dominios. Esto muestra la viabilidad del estudio de interacciones por RMN a pesar del tamaño de PCNA. Sin embargo, en los casos de los fragmentos PIP de las proteinas Eco 1 e ING1, se observó una unión débil.

      Hemos demostrado que la proteína Gadd45 es principalmente monomérica en disolución. Su estudio por RMN y la asignación de las resonancias de la proteína ha sido posible a pesar de su complejo comportamiento dinámico en disolución. La estructura tridimensional de Gadd45 consta de una lámina- paralela-antiparalela con 5 hélices- rodeándola y dos regiones desordenadas en el extremo N-terminal y en el bucle 4- 4. La estructura de Gadd45 es similar a la de Gadd45 de ratón aunque esta proteína forma un dímero con las hélices 2 y 3 en la superficie de dimerización No se ha detectado una interacción directa por RMN entre Gadd45 y PCNA, en contraste a resultados anteriormente publicados. Sin embargo, si hemos confirmado la interacción entre Gadd45 y la quinasa mitótica Aurora A. La superficie de interacción comprende las hélices 2 y 3, en la región opuesta a la localización de los extremos N- y C-terminales, Esta interacción no es compatible con la dimerización de Gadd45, lo cual es consistente con la hipótesis de que la dimerización de Gadd45 constituye un mecanismo de regulación de la función de Gadd45a en relación a su capacidad de interaccionar con otras proteínas.


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