Resumen de Desarrollo y optimización de métodos cromatográficos para el aislamiento de vesículas extracelulares y su uso en biopsia líquida
Existe un interés creciente en el uso de las vesículas extracelulares (EVs) como biomarcadores de enfermedades. Sin embargo, aún no se ha encontrado una técnica de aislamiento con la que se consiga obtener una muestra de una alta pureza, sin la presencia de contaminantes abundantes en muestras biológicas. El uso de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es uno de los mejores métodos de aislamiento por la pureza de las muestras obtenidas y su uso ha aumentado considerablemente en los últimos años. Por otro lado, las técnicas basadas en cromatografía de afinidad presentan características más adecuadas para el aislamiento de EVs en una rutina clínica al ser metodológicamente sencillas y rápidas. En la primera parte de esta tesis hemos analizado diferentes resinas de agarosa que varían en sus principales características; porcentaje de agarosa, tamaño de microesfera y nivel de entrecruzamiento; para el aislamiento de EVs a partir de medio condicionado y su separación de proteína soluble y lipoproteínas (LPPs). Tras demostrar que el porcentaje de agarosa de la resina define el límite de exclusión y que el tamaño de las microesferas es determinante para obtener una adecuada resolución de los distintos componentes de la muestra, se ha seleccionado la agarosa 4RRF como la mejor para el aislamiento de EVs a partir de medio condicionado. Esta resina, compuesta por un 4% de agarosa y por esferas más pequeñas, también ha demostrado ser superior en el aislamiento de EVs a partir de muestras de plasma sanguíneo en comparación a otras resinas comúnmente utilizadas en el campo y al método de ultracentrifugación diferencial. En la segunda parte de la tesis hemos utilizado esta resina mejorada para la separación y posterior análisis de EVs, LPPs y fracción soluble a partir de muestras de cáncer de pulmón. Hemos demostrado que los transcritos de la translocación EML4-ALK presente en las líneas celulares de cáncer de pulmón H2228 y H3122 se encuentran enriquecidos en EVs de su medio condicionado. Además, hemos puesto a punto un método de aislamiento de EVs a partir de muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña (CPCNP) para la detección de un número óptimo de transcritos del gen endógeno PUM1 en EVs, que pueda dar lugar en un futuro a la detección de la translocación EML4-ALK en muestras de pacientes con esta alteración. Por último, hemos desarrollado y puesto a punto un método de cromatografía de afinidad para el aislamiento de EVs pequeñas a partir de medio condicionado, basado en el reconocimiento de la curvatura de la membrana por un péptido derivado de bradiquinina (BP). Este péptido ha sido modificado con una cola de histidinas para su unión a agarosas catiónicas, de forma que el protocolo resultante para el aislamiento de EVs es rápido, sencillo y permite la elución suave de la muestra para una posterior caracterización y su uso en análisis funcionales
