Determinantes moleculares implicados en la resistencia a análogos a timidina y en la fidelidad de copia de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

• Autores: Tania Matamoros Grande
• Directores de la Tesis: Luis Menéndez Arias (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Enrique Tabares López (presid.), Mauricio García Mateu (secret.), Luis Blanco Dávila (voc.), José Rodríguez (voc.), C. López Galíndez (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
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• Resumen

  • ÍNDICE Página SUMMARY (RESUMEN EN INGLÉS) 1 1. INTRODUCCIÓN 3 1.1 El virus de la inmunodeficiencia humana 3 1.2 La RT del VIH-1 7 1.2.1 Características y función 7 1.2.2 Motivos conservados en las DNA y RNA polimerasas 8 1.2.3 Estructura de la RT 9 1.2.4 Residuos importantes para la actividad DNA polimerasa de la RT 11 1.2.5 Tratamiento antirretroviral 14 1.2.5.1 Inhibidores análogos a nucleósido 16 1.2.5.2 Inhibidores no análogos a nucleósido 24 1.3 Fidelidad de copia de la RT del VIH-1 25 1.3.1 Tipos de ensayos de fidelidad 26 1.3.1.1 Ensayos basados en una única ronda de replicación 26 1.3.1.2 Ensayos bioquímicos 27 1.3.1.3 Ensayos genéticos 29 1.3.2 Fidelidad de copia de mutantes de la RT del VIH-1 31 2. OBJETIVOS 36 3. MATERIALES Y MÉTODOS 38 3.1 Clonación de la región codificante de las RTs BH10 y SS en el plásmido pRT66B 38 3.2 Mutagénesis dirigida 39 3.3 Purificación de retrotranscriptasas 43 3.3.1 Purificación mediante expresión individual de las dos subunidades de la RT 44 3.3.1.1 Expresión de las subunidades p66 y p51 de la RT 44 3.3.1.2 Lisis de las bacterias y formación del heterodímero 44 3.3.1.3 Cromatografía de afinidad 45 3.3.1.4 Cromatografía de intercambio iónico 45 3.3.1.5 Comprobación de la pureza y la concentración de la enzima obtenida 46 3.3.2 Purificación de RTs mediante la expresión de la subunidad p66 y su posterior procesamiento 46 3.3.2.1 Expresión de la subunidad p66 de la RT 46 3.3.2.2 Lisis de las bacterias 47 3.3.2.3 Cromatografía de intercambio iónico 47 3.3.2.4 Cromatografía de afinidad 47 3.3.2.5 Comprobación de la pureza y la concentración de la enzima obtenida 48 3.4 Preparación de complejos DNA/DNA heteropoliméricos 48 3.5 Determinación de la concentración de enzima activa 50 3.6 Ensayos de bloqueo con inhibidores y posterior escisión y polimerización 51 3.7 Ensayos de retardo en gel 52 3.7.1 Bloqueo del iniciador con d4T-trifosfato (d4TTP) 52 3.7.2 Determinación de la afinidad de la RT por el complejo moldeiniciador bloqueado en el extremo 3"con d4T 53 3.7.3 Formación del complejo ternario estable y determinación de la afinidad de unión del dNTP (Kd[dNTP]aparente) 54 3.8 Ensayos de extensión de iniciadores en ausencia de un dNTP 55 3.9 Ensayos cinéticos para la determinación de la fidelidad de copia 56 3.9.1 Ensayos cinéticos en el estado estacionario 56 3.9.1.1 Incorporación de dNTPs correctos e incorrectos 56 3.9.1.2 Elongación de extremos desapareados 57 3.9.2 Ensayos cinéticos en el estado pre-estacionario 58 3.9.2.1 Incorporación de dNTPs correctos 58 3.9.2.2 Incorporación de dNTPs incorrectos 59 3.9.2.3 Elongación de extremos desapareados 60 3.10 Ensayos genéticos para la determinación de la fidelidad de copia 61 3.10.1 Construcción del molde de DNA 61 3.10.2 Reacción de síntesis de DNA 62 3.10.3 Preparación de células electrocompetentes 62 3.10.4 Electroporación y plaqueo 62 3.10.5 Análisis de los mutantes 63 4. RESULTADOS 66 4.1 Papel de la Tyr-215 y del Asp-67 en el mecanismo molecular de resistencia a NRTIs de RTs del VIH-1 portadoras de una inserción en el subdominio "fingers"66 4.1.1 Mutaciones de resistencia en la RT del VIH-1 asociadas a inserciones en el subdominio "fingers" 66 4.1.2 Escisión de AZT-monofosfato (AZTTP y d4T-monofosfato (d4TTP) de iniciadores de DNA bloqueados 68 4.1.3 Inhibición de la reacción de escisión por el siguiente nucleótido complementario 70 4.1.4 Formación de complejos ternarios estables 72 4.2 Estudio de inhibidores potenciales de la reacción de escisión 76 4.2.1 Efecto de análogos de timidina modificados en su fosfato ¿ sobre el mecanismo de resistencia a NRTIs de una RT del VIH-1, resistente a múltiples inhibidores 76 4.2.1.1 Derivados ¿-borano de NRTIs 76 4.2.1.1.1 Reacción de escisión mediada por ATP de iniciadores bloqueados con derivados ¿-borano de AZTTP 77 4.2.1.1.2 Reacción de escisión mediada por ATP de iniciadores bloqueados con derivados ¿-borano de d4TTP 80 4.2.1.1.3 Inhibición de la escisión de derivados ¿-borano de AZTTP y d4TTP 81 4.2.1.2 Tioderivados de AZTTP 82 4.2.2 Efecto de distintos donadores de PPi sobre el mecanismo de escisión de NRTIs 84 4.3 Análisis del efecto de mutaciones en la posición sobre la fidelidad de copia de la RT del VIH-1 86 4.3.1 Efecto de la sustitución de la Val-75 sobre la actividad polimerasa de la RT del VIH-1 88 4.3.2 Extensión de iniciadores en ausencia de un dNTP 89 4.3.2.1 Efecto de Be2+ y Mn2+ sobre la fidelidad de copia de la RT del VIH-1 92 4.3.3 Determinación de la fidelidad de copia de DNA en el estado estacionario 94 4.3.3.1 Discriminación entre dNTPs correctos e incorrectos 95 4.3.3.2 Extensión de complejos molde-iniciador con extremos desapareados 96 4.3.4 Determinación de la fidelidad de copia de DNA en el estado preestacionario 96 4.3.4.1 Discriminación entre dNTPs correctos e incorrectos 98 4.3.4.2 Extensión de complejos molde-iniciador con extremos desapareados 100 4.3.5 Fidelidad de copia de DNA analizada mediante ensayos genéticos 105 5. DISCUSIÓN 108 5.1 Determinantes moleculares de la resistencia a NRTIs en RTs portadoras de inserciones en el subdominio"fingers" 108 5.1.1 Influencia de la Tyr-215 en la actividad fosforolítica de la RT SS 109 5.1.2 Los dNTPs son capaces de inhibir la reacción de escisión responsable de la resistencia a inhibidores de la RT análogos a timidina 111 5.1.3 Localización estructural de la Tyr-215 y de la inserción Ser-Ser en la RT del VIH-1: Implicaciones en resistencia 114 5.1.4 Patrones de mutaciones encontradas in vivo y su correlación con los datos bioquímicos 115 5.2 Búsqueda de nuevas estrategias para la inhibición de la reacción de escisión, responsables de la resistencia a inhibidores de la RT análogos a timidina en cepas multirresistentes del VIH-1 117 5.2.1 Efecto de las modificaciones en los fosfatos del donador de PPi sobre la reacción de escisión 117 5.2.2 Introducción de un grupo borano en el fosfato ¿ de NRTIs y su impacto en la actividad fosforolítica de RTs multirresistentes 117 5.2.3 Introducción de un azufre en el fosfato ¿ de NRTIs y su impacto en la actividad fosforolítica de RTs multirresistentes 121 5.3 Fidelidad de RTs portadoras de cambios en la posición 75 122