Study of Porcine Sperm Functionality during Interaction with Male and Female Reproductive Fluids, and its Implication in Fertilization

Abstract

La industria porcina busca mejorar su productividad mediante la mejora de las técnicas de reproducción asistida, como la inseminación artificial (IA), y la comprensión de los procesos fisiológicos desde la eyaculación hasta la deposición del semen en el tracto genital femenino. El eyaculado se emite en varias fracciones (pre-espermática, espermática rica, intermedia, y post-espermática) que difieren en concentración espermática, volumen y composición del plasma seminal (PS). La fracción rica se utiliza comúnmente en la preparación de dosis seminales para la IA, mientras que la inclusión de la fracción post-espermática es objeto de debate. Por lo tanto, en el capítulo 1 se investigó el efecto de incluir las fracciones acumulativas del eyaculado en las dosis seminales, sobre la conservación de las mismas, rendimiento reproductivo y estado de salud de la descendencia después de la IA. Por ello se prepararon tres tipos de dosis seminales (2000x106 espermatozoides/60 ml): 1) F1: fracción espermática rica; 2) F2: F1 + fracción intermedia; 3) F3: F2 + fracción post-espermática. Las dosis se almacenaron (16°C, 3 días) y se analizó la calidad espermática antes de su uso para la IA de cerdas multíparas. Los resultados de los parámetros de calidad espermática y de fertilidad no mostraron diferencias significativas entre los grupos. Posteriormente, en el capítulo 2 los grupos experimentales (F1, F2, F3) fueron conservados a 16°C durante 5 días. Se analizó el metabolismo energético del eyaculado sin diluir y tras la preparación de las dosis seminales (día 1), y los parámetros de calidad espermática (día 1, 3 y 5) y no se observaron diferencias entre los grupos. En el día 5, se simularon las condiciones de estrés térmico (38.5°C, 300 minutos) y ambiente uterino (incubación con fluido uterino-FU a 38.5°C durante 180 minutos) a las que los espermatozoides están expuestos en el tracto reproductivo femenino. En ambas pruebas los grupos F2 y F3 mantuvieron una mejor calidad que F1. En el capítulo 3 se analizaron los parámetros de calidad espermática incubando los espermatozoides con FU en presencia o ausencia de PS a 38.5°C durante 180 minutos. Se observó que el FU tiene un efecto perjudicial en la funcionalidad espermática (motilidad y estado del acrosoma) a partir de 2 horas de incubación, y que el PS mitiga este efecto adverso. Por tanto, es importante entender los cambios que se producen en los espermatozoides durante estas interacciones. En el capítulo 4 se realizó un análisis proteómico de espermatozoides incubados con los fluidos reproductivos femeninos (FU y fluido oviductal-FO) en presencia o ausencia de PS. Los resultados mostraron un mayor número de proteínas en espermatozoides incubados con un solo fluido (PS, FU o FO) con respecto a cuando fueron incubados con dos fluidos (PS+FU y PS+FO), induciendo cambios en el proteoma espermático probablemente debido a un impedimento estérico. Además de la interacción con los fluidos, los espermatozoides sufren un proceso de selección en su trayecto hacia el sito de fecundación. Por lo tanto, en el capítulo 5 se analizó el efecto de PS y/o FU en la capacidad fecundante de los espermatozoides mediante la fecundación in vitro, y el metabolismo energético antes y después de un proceso de selección in vitro. Tras la selección, los espermatozoides incubados con FU mostraron mayor penetración y eficiencia, así como una mayor actividad metabólica. Además, se observó que el FU influye en los perfiles metabolómico, lipidómico y proteómico de los espermatozoides, lo que permitió la identificación de posibles biomarcadores de fertilidad. En conclusión, la inclusión de todas las fracciones del eyaculado no afecta el almacenamiento de las dosis ni el rendimiento reproductivo. Por lo tanto, se puede considerar el uso del eyaculado completo en la IA. Además, las interacciones complejas entre los espermatozoides y los fluidos reproductivos proporcionan información importante sobre los mecanismos involucrados en la funcionalidad espermática.

The porcine industry aims to improve its productivity by enhancing assisted reproductive techniques, such as artificial insemination (AI), and gaining a better understanding of the physiological processes from ejaculation to semen deposition in the female reproductive tract. The ejaculate is emitted in various fractions (pre-sperm, sperm-rich, intermediate, and post-spermatic fractions) that differ in sperm concentrations, volume, and seminal plasma (SP) composition. The sperm-rich fraction is commonly used in the preparations of seminal doses for AI, while the inclusion of the post-sperm fraction is a subject of debate. Therefore, in Chapter 1, the effect of including cumulative ejaculate fractions in seminal doses was investigated regarding their preservation, reproductive performance, and offspring health after artificial insemination (AI). Three types of seminal doses (2000x106 spermatozoa/60 ml) were prepared: 1) F1: sperm-rich fraction; 2) F2: F1 + intermediate fraction; 3) F3: F2 + post-sperm fraction. The doses were stored (16°C, 3 days), and sperm quality was analyzed before their use for AI in multiparous sows. The results of sperm quality parameters and fertility did not show significant differences between the groups. Subsequently, in Chapter 2, the experimental groups (F1, F2, F3) were stored at 16°C for 5 days. The energetic metabolism of undiluted ejaculate and after the preparation of seminal doses (day 1) was analyzed, and sperm quality parameters were evaluated on day 1, 3, and 5. No differences were observed between the groups. On day 5, thermal stress conditions (38.5 °C, 300 minutes) and uterine environment simulation (incubation with uterine fluid, UF, at 38.5 °C for 180 minutes) were applied to mimic the conditions to which spermatozoa are exposed in the female reproductive tract. In both tests, groups F2 and F3 maintained better quality than F1. In Chapter 3, sperm quality parameters were analyzed by incubating spermatozoa with UF in the presence or absence of SP at 38.5 °C for 180 minutes. It was observed that UF has a detrimental effect on sperm functionality (motility and acrosome status) after 2 hours of incubation, and SP mitigates this adverse effect. Therefore, it is crucial to understand the changes that occur in spermatozoa during these interactions. In Chapter 4, a proteomic analysis of spermatozoa incubated with female reproductive fluids (UF and oviductal fluid, OF) in the presence or absence of SP was conducted. The results revealed a higher number of proteins in spermatozoa incubated with a single fluid (SP, UF, or OF) compared to when they were incubated with two fluids (SP+UF and SP+OF), indicating changes in the sperm proteome, likely due to steric hindrance. In addition to the interaction with fluids, sperm undergo a selection process during their journey towards the fertilization site. Therefore, in Chapter 5, the effect of SP and/or UF on sperm fertilizing capacity was analyzed through in vitro fertilization, as well as the energetic metabolism before and after an in vitro selection process. Following selection, spermatozoa incubated with UF exhibited higher penetration and efficiency, along with increased metabolic activity. Furthermore, it was observed that UF influences the metabolomic, lipidomic, and proteomic profiles of spermatozoa, enabling the identification of potential fertility biomarkers. In conclusion, the inclusion of all ejaculate fractions does not impact dose storage or reproductive performance. Thus, the use of the entire ejaculate can be considered for AI. Additionally, the complex interactions between spermatozoa and reproductive fluids provide valuable insights into the mechanisms involved in sperm functionality.