Resumen de Obtención de hidrolizados de Quinua con actividad antioxidante y su efecto sobre el estrés oxidativo asociado a la hipertensión arterial
El objetivo global de esta Tesis Doctoral fue la obtención y desarrollo de hidrolizados de proteínas derivados de quinua con actividad antioxidante in vitro y con buen perfil sensorial, y evaluar el efecto beneficioso que ocasiona su administración frente al estrés oxidativo y/o sobre el desarrollo de hipertensión arterial (HTA) en modelos in vivo, así como investigar los posibles mecanismos de acción implicados en su actividad biológica.
La primera parte del trabajo consistió en la obtención de hidrolizados de quinua de tres variedades distintas: blanca, roja y negra, empleando diferentes enzimas de grado alimentario. Con el fin de seleccionar el hidrolizado más prometedor tanto a nivel biológico como sensorial se llevó a cabo, en primer lugar, una evaluación sensorial básica para descartar aquellos hidrolizados que presentaran atributos extraños o desagradables. En paralelo a la evaluación sensorial, se evaluó en cada uno de los hidrolizados la actividad antioxidante in vitro, determinada por su capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC, por sus siglas en inglés: Oxygen Radical Absorbance Capacity), y se cuantificaron los polifenoles totales mediante el método de Folin-Ciocalteu. En relación a los resultados obtenidos tras la evaluación sensorial de los hidrolizados, aquellos obtenidos con las proteasas Promod 279P, Flavorpro 373MDP, Flavorpro 750MDP y Alcalasa 2.4 LFG mostraron los resultados más prometedores, mientras que el resto de proteasas empleadas mostraron un perfil sensorial desagradable, principalmente relacionado con el sabor y el olor, incluso a tiempos cortos de hidrólisis. En concreto, el hidrolizado de quinua roja producido con Alcalasa 2.4 LFG con una duración aproximada de entre 1 y 4 horas fue el más prometedor, teniendo en cuenta los aspectos sensoriales básicos analizados, y presentó sabores agradables con notas dulces y olores neutros.
Los resultados de la medida de la actividad antioxidante in vitro mostraron que, entre las diferentes variedades de quinua hidrolizadas y a tiempos de hidrólisis inferiores a las 6 horas (momento en el que el perfil sensorial se ve afectado de manera negativa), los hidrolizados que mostraron los mejores resultados fueron los obtenidos con las enzimas Alcalasa 2.4 LFG y Flavorpro 373MDP en un rango de 432,1 y 2204,3 μmol ET/g de proteína y, de forma general, fueron los hidrolizados de quinua blanca los que presentaron una actividad antioxidante más baja tras la hidrólisis enzimática, cuando se compararon con los hidrolizados de quinua roja y negra. En el caso de la determinación del contenido de compuestos fenólicos, se observó un descenso gradual de estos compuestos conforme transcurría el proceso de hidrólisis. De las diferentes variedades, la quinua negra mostró un contenido de compuestos fenólicos superior y, en concreto, los valores más altos se encontraron en la quinua negra sin hidrolizar, que llegó a alcanzar 81 mg Equivalentes de Ácido Gálico (GAE)/100 g de quinua. Estos resultados sugieren que el incremento en la actividad antioxidante que se produce en los hidrolizados obtenidos a partir de las diferentes variedades de quinua, no parece estar relacionado con el contenido de compuestos fenólicos, sino más bien con la liberación de otros compuestos con potencial antioxidante, como es el caso de los péptidos bioactivos.
Tras llevar a cabo la evaluación sensorial y analizar la actividad antioxidante in vitro de los diferentes hidrolizados de quinua desarrollados, se seleccionó finalmente el hidrolizado de quinua roja producido con Alcalasa 2.4 LFG durante 2 horas, por presentar de forma simultánea un elevado potencial antioxidante (1118,4 ± 17,9 μmol ET/g de proteína) y un óptimo perfil sensorial. En este hidrolizado se evaluó a continuación la actividad antioxidante in vivo utilizando como organismo modelo Saccharomyces cerevisiae BY4741. En este estudio se puso a prueba la capacidad de diferentes dosis del hidrolizado de quinua seleccionado (1 μL, 5 μL, 10 μL y 20 μL) para inhibir el estrés oxidativo provocado en la célula mediante la incorporación de un agente oxidante (peróxido de hidrógeno). Se evaluaron para ello la tasa de crecimiento, la capacidad de carga y el recuento de viables, y se comparó el efecto del hidrolizado de quinua respecto al ocasionado por el grupo control sin tratamiento y con agente oxidante, y respecto a otros antioxidantes de referencia como la vitamina C y el resveratrol. La administración del hidrolizado de quinua roja con alcalasa en el estudio realizado en Saccharomyces cerevisiae BY4741 ocasionó una mayor capacidad de carga y recuento de viables respecto al grupo control con tratamiento oxidante, al grupo suplementado con vitamina C y al grupo suplementado con resveratrol. Los resultados obtenidos en este modelo experimental corroboraron in vivo las propiedades antioxidantes del hidrolizado de quinua roja seleccionado que se habían descrito previamente en los ensayos in vitro. Esto es importante ya que la biodisponibilidad, reactividad y estabilidad de un determinado compuesto in vivo, puede modificarse con respecto a la capacidad antioxidante observada in vitro.
Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió investigar si las propiedades antioxidantes del hidrolizado seleccionado podrían mitigar el estrés oxidativo asociado a la enfermedad cardiovascular y, concretamente, si podrían mejorar la HTA y sus complicaciones asociadas. Para ello, se evaluó el efecto del consumo del hidrolizado de quinua roja con alcalasa en un modelo animal de HTA de origen genético, como es la rata SHR (por sus siglas en inglés: Spontaneously Hypertensive Rat), y en su control normotenso, la rata Wistar Kyoto (WKY, por sus siglas en inglés: Wistar Kyoto). Las ratas SHR se dividieron en 4 grupos de 8 animales cada uno a los que se administró: hidrolizado de quinua roja (1000 mg/kg/día), hidrolizado de quinua roja (250 mg/kg/día), vitamina C (250 mg/kg/día) o agua corriente filtrada sin tratamiento antioxidante. Las ratas WKY se dividieron en 3 grupos de 8 animales a los que se administró: hidrolizado de quinua roja (1000 mg/kg/día), vitamina C (250 mg/kg/día) o agua corriente filtrada sin tratamiento antioxidante. Durante las 8 semanas de duración del estudio se registraron semanalmente el peso corporal, la ingesta sólida y la ingesta líquida. También se evaluó la presencia o desarrollo de neuropatía periférica (sensibilidad mecánica) mediante el método de los filamentos de Von Frey en la semana inicial, en la semana 6 y al finalizar el estudio. Además, tanto al inicio como al finalizar el periodo experimental se midió la presión arterial sistólica (PAS) de los animales mediante el método no invasivo basado en una modificación de la técnica de manguito en la cola. Transcurridas las 8 semanas de estudio, los animales fueron sacrificados y se extrajeron muestras de sangre, de diferentes tejidos de interés (corazón, hígado, riñón, aorta, cerebro, bazo, pulmón, músculo, tejido adiposo epididimal y tibia) de los que se registró su peso, y de las heces. Con la finalidad de realizar distintos ensayos para intentar dilucidar los posibles mecanismos de acción implicados en el efecto del hidrolizado de quinua en este modelo experimental, se determinó la capacidad antioxidante y los niveles de malonildialdehído (MDA) en plasma, hígado, corazón, aorta y riñón. Además, en el caso del hígado se examinó la concentración de glutatión reducido. Los resultados se contrastaron con los obtenidos en el grupo control sin tratamiento antioxidante y tras la administración de vitamina C, y también se evaluó y comparó el efecto de los distintos tratamientos con los obtenidos en sus controles normotensos, las ratas WKY.
En el estudio realizado en ratas, se observó que el consumo del hidrolizado de quinua roja con alcalasa, tanto en ratas WKY como SHR, provocó una ingesta líquida significativamente superior a la de sus respectivos grupos control. Estos resultados podrían explicarse por las características organolépticas del hidrolizado de quinua roja seleccionado que favoreció una mayor ingesta líquida al resultar más palatable. En el caso de los pesos relativos de los distintos tejidos investigados, no se observaron diferencias significativas entre los distintos grupos experimentales, a excepción del hígado. En este sentido se observó que el grupo de ratas SHR tratadas con la dosis más alta del hidrolizado de quinua roja con alcalasa (1000 mg/kg/día) presentó un peso relativo de dicho órgano inferior respecto a su grupo control. Estas diferencias sugieren que el consumo de hidrolizado de quinua roja podría atenuar los cambios estructurales y/o funcionales que ocurren en este tejido y que están asociados al desarrollo de la HTA.
Además, tanto en las ratas WKY como en las ratas SHR, la administración del hidrolizado de quinua roja con alcalasa logró atenuar el desarrollo de alodinia mecánica que sí se observó en el grupo tratado con vitamina C y en el grupo control. De esta manera, se evidencia el potencial del hidrolizado de quinua roja con alcalasa para mitigar el desarrollo de neuropatía periférica, tanto en los estadios iniciales de la enfermedad (pre-hipertensión), como una vez instaurada la HTA.
En relación a la medida indirecta de presión arterial, la administración del hidrolizado de quinua roja con alcalasa ocasionó una reducción significativa de la PAS en ratas SHR tratadas con 1000 mg/kg/día respecto a sus valores iniciales (-9,8 ± 4,5 mmHg). En cambio, no se constataron diferencias significativas en los valores de la PAS en el resto de grupos experimentales de ratas SHR, entre los que se observó sin embargo un ligero aumento de esta variable a lo largo del estudio. Tampoco se evidenciaron diferencias significativas entre ninguno de los grupos de ratas WKY, lo que pone de manifiesto que el efecto antihipertensivo del hidrolizado de quinua roja con alcalasa es propio de la condición de HTA.
Los resultados obtenidos sobre el estudio de biomarcadores de estrés oxidativo mostraron, que el consumo de 1000 mg/kg/día del hidrolizado de quinua roja con alcalasa en ratas SHR, ocasionó un aumento de la capacidad antioxidante del riñón respecto al resto de grupos experimentales. Estos resultados sugieren que la administración del hidrolizado de quinua roja con alcalasa podría suponer una mejora en el mecanismo de defensa frente a las posibles alteraciones a nivel renal ocasionadas por el estrés oxidativo vinculado a la HTA. Estas diferencias no se observaron en el plasma ni en el resto de tejidos analizados (hígado, corazón y aorta).
Los niveles de glutatión reducido en el hígado disminuyeron de forma significativa en las ratas SHR control con respecto a su control normotenso, lo que pone de manifiesto las implicaciones de este compuesto antioxidante en el origen y desarrollo del HTA. Asimismo, la administración del hidrolizado de quinua roja con alcalasa en una dosis de 1000 mg/kg/día provocó un incremento de los niveles de glutatión reducido en este tejido comparado con el grupo de ratas SHR control. Por tanto, el consumo del hidrolizado de quinua roja con alcalasa, por su carácter antioxidante y en una dosis suficiente, podría inducir un aumento en la biosíntesis de glutatión reducido, un marcador esencial de la defensa antioxidante intracelular y clave en el desarrollo de HTA.
Del mismo modo, en las ratas SHR el consumo del hidrolizado de quinua roja con alcalasa en una dosis de 1000 mg/kg/día, disminuyó significativamente los niveles de MDA en plasma y riñón respecto al grupo control, mejorando así los niveles de peroxidación lipídica en estos animales. Estos hallazgos observados podrían explicarse, al menos en parte, por el aumento de la actividad antioxidante a nivel plasmático y renal observado en el grupo tratado con el hidrolizado de quinua roja con alcalasa en una dosis de 1000 mg/kg/día que, aunque sin diferencias significativas en el caso del plasma respecto al grupo control de ratas SHR, la tendencia observada pone de manifiesto la posibilidad de que esta vía estuviera involucrada en la inhibición de la peroxidación lipídica en el plasma y el riñón. En el caso del corazón, la administración de las dos dosis de hidrolizado de quinua roja con alcalasa empleadas (250 mg/kg/día y 1000 mg/kg/día), y también la administración de vitamina C ocasionaron una disminución de los niveles de MDA en ratas SHR respecto al grupo control. La reducción de la peroxidación lipídica reportada en el corazón tras la administración del hidrolizado de quinua roja con alcalasa podría relacionarse con la reducción de la presión arterial observada en este estudio, si tenemos en consideración que los pacientes hipertensos suelen manifestar comúnmente un incremento de los niveles de MDA a nivel sistémico.
En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han demostrado el efecto antioxidante in vitro e in vivo del hidrolizado de quinua roja con Alcalasa 2.4 LFG y su capacidad para mejorar la HTA y sus complicaciones asociadas. En el momento actual continuamos esta línea de investigación para profundizar en el mecanismo de acción de este hidrolizado mediante la realización de estudios histológicos, análisis de otros biomarcadores, estudios de expresión génica y expresión proteica y análisis de la microbiota intestinal. Por último, este trabajo abre la puerta a otros estudios experimentales con hidrolizados de quinua que permitan, en última instancia, que estos productos lleguen a comercializarse como ingredientes funcionales en alimentos o bebidas que mejoren las distintas patologías relacionadas con el estrés oxidativo como la HTA. Para ello, serán necesarios estudios de intervención que demuestren su eficacia y seguridad en humanos.
