Pared celular, β-lactamasa AmpC, sistema inmune y virulencia: nuevas conexiones y hallazgos en Pseudomonas aeruginosa

Abstract

[cat] A l'actual escenari d'increment progressiu en la resistència als antimicrobians, el nostre arsenal antibiòtic es veu compromès de manera creixent. Això és especialment preocupant en patògens tan rellevants com Pseudomonas aeruginosa, una de les primeres causes d'infeccions agudes nosocomials i cròniques en pacients amb patologies respiratòries subjacents, i que de fet suposen una greu amenaça clínico-epidemiològica per la seva elevada morbi-mortalitat. Per tant, és d'extrema urgència la recerca d'opcions antipseudomòniques alternatives des de diferents perspectives, com ara les dirigides a deshabilitar els mecanismes de resistència antibiòtica, o les dirigides a atenuar la virulència del patogen. En aquest sentit, el nostre grup va demostrar en el passat que la combinació del bloqueig del reciclatge del peptidoglicà (PGN) i la sobreexpressió de la β-lactamasa cromosòmica AmpC (principal mecanisme de resistència de P. aeruginosa) causa una dràstica atenuació de virulència en aquesta espècie. A més, també demostràrem prèviament el paper indispensable del esmentat reciclatge per habilitar la hiperproducció d'AmpC i per tant la resistència basada en aquesta β-lactamasa. Per conèixer les implicacions terapèutiques d'aquests antecedents, decidim dur a terme un estudi multidisciplinari, en què hem descrit per primera vegada la utilitat de la colistina en concentració subinhibitòria per potenciar l'efectivitat antipseudomònica dels elements del nostre sistema immune que ataquen el PGN (lisozima i Peptidoglycan Recognition Proteins), i hem aconseguit vincular el bloqueig del reciclatge del PGN a un dràstic augment en la sensibilitat de P. aeruginosa davant d'aquestes armes immunitàries in vitro. A més, hem demostrat que la suma del bloqueig del reciclatge més hiperproducció d'AmpC és causant d'una disminució en la quantitat de PGN/cèl·lula molt probablement vinculat al fenotip de sensibilitat extrema davant dels atacs immunitaris esmentats. Addicionalment, la caracterització d'àmplies col·leccions de soques de P. aeruginosa (procedents d'infecció aguda vs crònica) ens ha permès: i) trobar noves dianes potencialment terapèutiques com la lligasa Mpl (també participant del reciclatge del PGN), la inactivació de la qual causa un increment addicional en la capacitat antipseudomònica de la lisozima; i ii) apreciar que el PGN de P. aeruginosa és una estructura molt estable i poc subjecta a canvis adaptatius des del punt de vista bioquímic, en comparació amb altres espècies. A més, hem validat en model murí aquestes troballes in vitro, de manera que mitjançant l'ús de soques defectives en gens clau per al reciclatge del PGN (ampG o nagZ), vam poder corroborar un descens espectacular en la seva virulència sobre l'animal (probablement gràcies a sensibilització davant les armes immunes que ataquen la paret), així com una desactivació total de la resistència AmpC-dependent. Així doncs, totes aquestes troballes validen el reciclatge del PGN de P. aeruginosa com una excel·lent diana per al futur desenvolupament tant de teràpies antivirulència com antiresistència. D'altra banda, davant la manca de coneixement sobre els fragments procedents del PGN (muropèptids) que sustenten la hiper-producció estable d'AmpC a P. aeruginosa, vam decidir dur a terme un estudi [utilitzant UPLC-MS (Ultra High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry)] per identificar i caracteritzar aquests senyals. Aquest treball ens ha permès establir un model pioner en P. aeruginosa que identifica els anhidro-muro-pentapèptids i anhidro-muro-tripèptids com els senyals activadors de l'expressió d'ampC, si bé amb interessants diferències qualitatives i quantitatives en funció de les rutes mutacionals implicades i nivells de producció de AmpC. Aquest model, en què els anteriorment identificats senyals repressors semblen tenir poc pes, ens ajuda a comprendre millor els fonaments de la resistència AmpC-dependent a P. aeruginosa, apropant-nos a noves concepcions terapèutiques destinades a interferir amb la senyalització derivada del PGN i conseqüentment bloquejar la producció d'AmpC.

[spa] En el actual escenario de incremento progresivo en la resistencia a los antimicrobianos, nuestro arsenal antibiótico se ve comprometido crecientemente. Ello es especialmente preocupante en patógenos tan relevantes como Pseudomonas aeruginosa, una de las primeras causas de infecciones agudas nosocomiales y crónicas en pacientes con patologías respiratorias subyacentes, y que de hecho suponen una grave amenaza clínicoepidemiológica por su elevada morbi-mortalidad. Por lo tanto, es de extrema urgencia la búsqueda de opciones antipseudomónicas alternativas desde diferentes perspectivas, como por ejemplo las dirigidas a deshabilitar sus mecanismos de resistencia antibiótica, o las dirigidas a atenuar la virulencia del patógeno. En este sentido, nuestro grupo demostró en el pasado que la combinación del bloqueo del reciclaje del peptidoglicano (PGN) y la sobreexpresión de la β-lactamasa cromosómica AmpC (principal mecanismo de resistencia de P. aeruginosa) causa una drástica atenuación de virulencia en esta especie. Además, también demostramos previamente el papel indispensable del citado reciclaje para habilitar la hiperproducción de AmpC y por tanto la resistencia basada en esta β–lactamasa. Para conocer las implicaciones terapéuticas de estos antecedentes, decidimos llevar a cabo un estudio multidisciplinar, en el que hemos descrito por vez primera la utilidad de la colistina en concentración subinhibitoria para potenciar la efectividad antipseudomónica de los elementos de nuestro sistema inmune que atacan al PGN (lisozima y Peptidoglycan Recognition Proteins), y hemos logrado vincular el bloqueo del reciclaje del PGN a un drástico aumento en la sensibilidad de P. aeruginosa ante estas armas inmunitarias in vitro. Además, hemos demostrado que la suma del bloqueo del reciclaje más hiperproducción de AmpC es causante de una disminución en la cantidad de PGN/célula muy probablemente vinculado al fenotipo de sensibilidad extrema ante los mencionados ataques inmunitarios. Adicionalmente, la caracterización de amplias colecciones de cepas de P. aeruginosa (procedentes de infección aguda vs crónica) nos ha permitido: i) hallar nuevas dianas potencialmente terapéuticas como la ligasa Mpl (también participante del reciclaje del PGN), cuya inactivación causa un incremento adicional en la capacidad antipseudomónica de la lisozima; y ii) apreciar que el PGN de P. aeruginosa es una estructura muy estable y poco sujeta a cambios adaptativos desde el punto de vista bioquímico, en comparación con otras especies. Además, hemos validado en modelo murino estos hallazgos in vitro, de manera que mediante el uso de cepas defectivas en genes clave para el reciclaje del PGN (ampG o nagZ), pudimos corroborar un espectacular descenso en su virulencia sobre el animal (probablemente gracias a la sensibilización ante las armas inmunes que atacan a la pared), así como una desactivación total de la resistencia AmpC-dependiente. Así pues, todos estos hallazgos validan al reciclaje del PGN de P. aeruginosa como una excelente diana para el futuro desarrollo tanto de terapias anti-virulencia como anti-resistencia. Por otro lado, ante la falta de conocimiento acerca de los fragmentos procedentes del PGN (muropéptidos) que sustentan la hiperproducción estable de AmpC en P. aeruginosa, decidimos llevar a cabo un estudio [utilizando UPLC-MS (Ultra High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry)] para identificar y caracterizar estas señales. Este trabajo nos ha permitido establecer un modelo pionero en P. aeruginosa que identifica a los anhidro-muro-pentapéptidos y anhidro-muro–tripéptidos como las señales activadoras de la expresión de ampC, si bien con interesantes diferencias cualitativas y cuantitativas en función de las rutas mutacionales implicadas y niveles de producción de AmpC. Este modelo, en el que las anteriormente identificadas señales represoras parecen tener poco peso, nos ayuda a comprender mejor los fundamentos de la resistencia AmpC-dependiente en P. aeruginosa, acercándonos a nuevas concepciones terapéuticas destinadas a interferir con la señalización derivada del PGN y consecuentemente bloquear la producción de AmpC.

[eng] In the current scenario of progressive increase of antimicrobial resistance, our antibiotic arsenal is increasingly compromised. This is especially worrisome in pathogens as relevant as Pseudomonas aeruginosa, one of the first causes of acute nosocomial and chronic infections in patients with underlying respiratory diseases, and which in fact pose a serious clinical-epidemiological threat due to their high morbidity and mortality. Therefore, the search for alternative antipseudomonal options from different perspectives is of extreme urgency, such as those aimed at disabling its antibiotic resistance mechanisms, or those aimed at attenuating the virulence of the pathogen. In this sense, our group demonstrated in the past that the combination of peptidoglycan (PGN) recycling blockade and overexpression of chromosomal β-lactamase AmpC (the main resistance mechanism of P. aeruginosa) causes a drastic attenuation of virulence in this species. Furthermore, we also previously demonstrated the indispensable role of the aforementioned recycling to enable the hyperproduction of AmpC and therefore the resistance based on this β-lactamase. In order to know the therapeutic implications of these antecedents, we decided to carry out a multidisciplinary study, in which we have described for the first time the usefulness of colistin at subinhibitory concentration to enhance the antipseudomonal effectiveness of the elements of our immune system targeting the PGN (lysozyme and Peptidoglycan Recognition Proteins), and we have managed to link the blockage of PGN recycling to a drastic increase in the susceptibility of P. aeruginosa to these immune weapons in vitro. Furthermore, we have shown that the combination of the blockade of recycling plus hyper-production of AmpC is the cause of a decrease in the amount of PGN/cell, most likely linked to the phenotype of extreme susceptibility to the aforementioned immune attacks. Additionally, the characterization of large collections of P. aeruginosa strains (from acute vs chronic infection) allowed us to: i) find new potentially therapeutic targets such as Mpl ligase (also a participant in PGN recycling), whose inactivation causes an additional increase in the antipseudomonal capacity of lysozyme; and ii) to appreciate that the PGN of P. aeruginosa is a very stable structure and little subject to adaptive changes from the biochemical point of view, in comparison with other species. In addition, we have validated these in vitro findings in a murine model, so that by using strains defective in key genes for PGN recycling (ampG or nagZ), we were able to corroborate a spectacular decrease in virulence on the animal (probably thanks to sensitization to immune weapons targeting the cell-wall), as well as a total deactivation of AmpC-dependent resistance. Thus, all these findings validate the PGN recycling of P. aeruginosa as an excellent target for the future development of both anti-virulence and antiresistance therapies. On the other hand, due to the lack of knowledge about the fragments from PGN (muropeptides) that support the stable hyper-production of AmpC in P. aeruginosa, we decided to carry out a study [using UPLC-MS (Ultra High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry)] to identify and characterize these signals. This has allowed us to establish a pioneer model in P. aeruginosa that identifies the anhydro-muramilpentapeptides and anhydro-muramil-tripeptides as the activating signals of the expression of ampC, although with interesting qualitative and quantitative differences depending on the mutational pathways involved and levels of AmpC production. This model, in which the previously identified repressor signals seem to have little impact, helps us to better understand the bases for AmpC-dependent resistance in P. aeruginosa, bringing us closer to new therapeutic conceptions aimed at interfering with PGN-derived signaling and consequently block the production of AmpC.