Botrytis cinerea y las nonribosomal peptide synthetases (nrps): estudio de la implicación en el ciclo infectivo del fitopatógeno
- Autores: Ana Fernández Morales
- Directores de la Tesis: Jesús Manuel Cantoral Fernández (dir. tes.), María Carbú Espinosa de los Monteros (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cádiz ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Gerardo Pisabarro de Lucas (presid.), Gustavo Cordero Bueso (secret.), María Dolores Vela Delgado (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Recursos Agroalimentarios por la Universidad de Cádiz
- Materias:
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- Resumen
Durante el proceso de infección de la uva por el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea existe un continuo diálogo molecular entre ambos organismos, lo que hace que sea considerado un proceso dinámico. En el contacto entre el patógeno y el huésped se produce una reprogramación del transcriptoma y metaboloma, lo que desencadena la producción de numerosos metabolitos. Entre las sustancias que ven aumentada su concentración en Vitis vinífera durante esta reprogramación son las poliaminas, las cuales están presentes en todas las células y que se encuentran relacionadas con la expresión de genes, el proceso de crecimiento y la apoptosis celular.
Las poliaminas han sido usadas previamente como agentes epigenéticos, es decir, para modificar la expresión de genes, en concreto, en fermentaciones del hongo filamentoso Penicillium chrysogenum. Para ello, se suplementaron los medios de fermentación con el 1,3-diaminopropano y se logró provocar el aumento de la expresión del primer gen de la ruta biosintética de la penicilina el cual codifica para una péptido sintasa no ribosomal (NRPS).
Se estima que B. cinerea es capaz de producir hasta 40 metabolitos secundarios diferentes, en base a los enzimas claves de metabolismo secundario que presenta codificados en su genoma, sin embargo, actualmente se conocen menos del 28%. La dificultad del estudio de estos compuestos y de los genes implicados en su biosíntesis, radica en el desconocimiento de las condiciones bajo las cuales se producen en la naturaleza.
Con estos antecedentes y sabiendo que según la base de datos Mycocosm, B. cinerea tiene anotado en su genoma 9 genes que codifican para las NRPS, de los cuales solo se conoce la función de los genes Bcnrps2,3,6 y 7, se plantea como objetivo en la presente Tesis Doctoral estudiar los perfiles de expresión de los 9 genes mediante RT-qPCR en fermentaciones suplementadas con concentraciones subletales de espermina, espermidina y 1,3-diaminopropano empleados como modificadores epigenéticos. Bajo estas condiciones de estudio, las tres poliaminas fueron capaces de modificar los perfiles de expresión de los nueve genes NRPS de B. cinerea. De todos ellos, el gen Bcnrps1 fue el que sufrió un aumento estadísticamente significativo de su expresión.
Para profundizar en la función que ejerce el gen Bcnrps1 en el ciclo de vida del hongo, se realizó la deleción del mismo en la cepa B. cinerea B05.10 siguiendo la metodología de transformación de los protoplastos. Específicamente se siguió el método de transformación génica dirigida mediante recombinación homóloga con una construcción génica que contiene el gen de resistencia al antibiótico higromicina, como agente se selección. Una vez obtenido el mutante en el gen Bcnrps1 se procedió a la caracterización del mismo mediante el estudio de su implicación en aquellas funciones que han sido previamente descrita para este tipo de genes. Los resultados han mostrado que la deleción del gen Bcnrps1 produce un aumento en la excreción de sideróforos como consecuencia de la sobreexpresión de los genes Bcnrps3 y Bcnrps6, una disminución de la tolerancia a sustancias tóxicas exógenas tales como el pirimetanil (fungicida de uso común en agricultura para el control del fitopatógeno) y la polaimina espermidina. Además, se ha podido comprobar que se tras la deleción se produce un cambio en los perfiles metabólicos de las toxinas con esqueleto de botriano en la cepa mutante comparativamente con la cepa silvestre, produciéndose una acumulación de las toxinas botridial y botriendial respecto a los metabolitos dihidrobotridial y botrienalol. Por último, se ha demostrado que el gen Bcnrps1 no es esencial para la infección del hongo fitopatógeno, sin embargo, la cepa mutante muestra ser más agresiva y virulenta durante la infección en uva y manzana, lo que puede estar directamente relacionado con la acumulación de la toxina botridial responsable de las lesiones necróticas en los huéspedes de este patógeno.
Por último, se ha realizado el análisis del transcriptoma de B. cinerea durante su infección en uva blanca madura en la etapa post cosecha. La elección se este fruto se realizó en base a las elevadas pérdidas que provoca el hongo al sector agroalimentario y, específicamente en el fruto recolectado porque en dicha etapa los cultivos siguen siendo susceptibles a la infección por parte del hongo, siendo la interacción planta - patógeno dependiente del tipo de huésped y de la fase de maduración del fruto. Tras el análisis comparativo del transcriptoma de B. cinerea B05.10 infectado en uva respecto a su crecimiento en medio de cultivo, el 31% de los genes codificados en el genoma de B. cinerea B05.10 se expresaron diferencialmente tras 7 días de infección de las bayas de uva blanca madura tras la cosecha. Los genes expresados diferencialmente se clasificaron en 14 grupos diferentes en base a la función que desempeñan. Entre los genes que se encuentran regulados positivamente estaban los genes que codifican para las enzimas activas de hidrato de carbono (CAZymes); los relacionados con la respuesta del hongo fitopatógeno a la luz; los implicados en los procesos de detoxificación y de desarrollo de B. cinerea; algunos implicados en la regulación de la señalización y transcripción de genes; genes que codifican para la síntesis de metabolismos secundarios; genes implicados en virulencia y patogenicidad y los genes denominados PIO. Conjuntamente, durante la infección de la uva madura, aparecieron diferencialmente expresados de forma positiva un grupo de genes localizados en el cromosoma 17, que podrían conformar un posible cluster NRPS-like, el cual no se encuentra anotado en el genoma de B. cinerea B05.10. Otros genes que, si se encuentran anotados y, se sobreexpresaron en el fitopatógeno fueron los genes bop2, Bccao1 y Bcphs1, implicados en la biosíntesis de los carotenoides. Además, durante el proceso de infección de la uva blanca madura postcosecha, se detectaron diversos genes regulados negativamente entre los que cabe destacar: dos genes reguladores de la ruta de biosíntesis del pigmento rojo bikaverina, cinco de los genes implicados en la ruta de biosíntesis del ácido botcínico, cuatro genes reguladores dependientes de la luz y, dos genes que participan en la vía de señalización HOG.
El estudio comparativo de los genes diferencialmente expresados en B. cinerea durante el proceso de infección en diversos hospedadores y estados de maduración del mismo, han permitido sugerir que existen genes esenciales, necesarios para la interacción planta-patógeno, independientemente de la etapa de maduración de la uva, el momento de desarrollo de la infección o los hospedadores.
El análisis transcriptómico de B. cinerea durante la infección postcosecha de las bayas de uvas maduras ha permitido profundizar en el proceso de infección del hongo, estableciendo numerosos genes implicados en dicho proceso, los cuales son potenciales dianas moleculares para el desarrollo de nuevos tratamientos, más específicos y selectivos, para poder controlar las infecciones postcosecha. Estos nuevos métodos harían posible la reducción del empleo de fungicidas químicos, siendo más respetuosos con el medio ambiente además de, contribuir positivamente a reducir el problema mundial generado por la pérdida y el desperdicio de los alimentos.
