Evaluación del sistema maldi-tof vitek mstm para la identificación rápida de microorganismos de interés clínico
- Autores: Carlos Ruiz de Alegría Puig
- Directores de la Tesis: Jesús Navas Méndez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Guillermo Quindós Andrés (presid.), Asunción Seoane Seoane (secret.), Javier Fernandez Dominguez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad de Cantabria
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: UCrea
- Resumen
- español
Introducción: La identificación de los microorganismos ha sido una de las principales tareas del microbiólogo a través de los tiempos. Con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable del proceso infeccioso y para conocer las implicaciones patogénicas/patológicas, la evolución clínica, y aplicar una terapia antimicrobiana eficaz, un pilar fundamental en la práctica de la microbiología clínica hasta finales del siglo pasado lo constituye la identificación a nivel de especie de un aislamiento microbiano.
La observación de que diferentes microorganismos expresaban diferentes actividades enzimáticas, como la hidrólisis de urea o la producción de indol, fue utilizada para reunirlos, estableciendo diferentes grupos. Pero la ejecución de esa reacciones enzimáticas en tubos limitaba el número de análisis que se podían realizar, por lo que la tecnología evolucionó hacia la miniaturización, produciéndose las reacciones en pequeñas galerías que concentraban en unos cuantos pocillos todas las pruebas.
Más tarde llegaron las técnicas fluorométricas automatizadas, realizadas en microplacas, que han perdurado hasta nuestros días. Pero el concomitante uso de tarjetas y casetes generaba muchos residuos y, en ocasiones, los equipos se averiaban paralizando el funcionamiento habitual del laboratorio.
Otro avance más ha sido la introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en los laboratorios. La secuenciación del gen codificante para el 16S rRNA es la técnica de referencia para la identificación de las bacterias a nivel de especie. Sin embargo, no forma parte de la rutina de la mayoría de los laboratorios de microbiología clínica, debido a su alto coste, y a la necesidad de personal especializado. Además, un nuevo sistema en el diagnóstico microbiológico que se está introduciendo en los laboratorios de microbiología, es la secuenciación masiva. La continua mejora y desarrollo de los métodos de secuenciación ha permitido la accesibilidad del genoma completo a los laboratorios, lo cual implica gestionar una gran cantidad de información con nuevas herramientas bioinformáticas.
Finalmente, la espectrometría de masas (EM) ha irrumpido con fuerza en los laboratorios, en principio, para la identificación de microorganismos y es una técnica de análisis que permite caracterizar muestras midiendo las masas (estrictamente la relación masa/carga) de las moléculas componentes.
La motivación de la tesis fue demostrar que la espectrometría de masas MALDI-TOF es una técnica fiable, rápida y precisa que permite identificar a nivel de especie la mayor parte de los microorganismos presentes en muestras de origen humano clínicamente relevantes, de manera que puede utilizarse en la rutina diaria de un laboratorio de microbiología clínica como alternativa o complemento a las técnicas tradicionales.
Desarrollo teórico: Para validar esta hipótesis se planteó el objetivo inicial de evaluar la técnica en una colección de cepas que incluía una variedad de especies representativa de las aisladas con más frecuencia en nuestro laboratorio. Para ello se analizaron 950 aislamientos clínicos recogidos entre los meses de noviembre de 2011 a enero de 2012 en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (HUMV) de Santander, y se analizaron tanto por el sistema MALDI-TOF VITEK MSTM (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) como por los métodos clásicos de identificación bacteriana.
A continuación, nos planteamos evaluar la aplicación de la técnica para resolver la identificación a nivel de especie de 3 grupos de microorganismos que habían planteado problemas de identificación en nuestro laboratorio: el complejo Acinetobacter baumannii (ACB), Rhodococcus equi / Dietzia spp. y Candida spp.. En el caso del complejo ACB la identificación se realizó mediante el análisis de restricción de ADN ribosomal amplificado (ARDRA) y MALDI-TOF, resolviéndose las discrepancias mediante la secuenciación parcial del gen rpoB. Para el grupo de Rhodococcus equi y Dietzia spp. la comparativa se realizó mediante el sistema MALDI-TOF y la PCR basada en la amplificación del gen choE, como método de referencia. En el grupo de los aislados de Candida spp. se comparó el sistema MALDI-TOF con los sistemas tradicionales de identificación de levaduras, resolviéndose las discrepancias mediante secuenciación de las regiones inter-espaciadoras o ITS (Internal Transcribed Spacer). Además, gracias a colaboraciones con otros centros, tanto el grupo del complejo Acinetobacter baumannii como en el de Rhodococcus equi / Dietzia spp. se pudieron analizar también con el sistema MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Billerica, MA).
Conclusiones: 1.- Hemos demostrado una alta correlación entre los resultados obtenidos mediante el sistema MALDI-TOF Vitek MSTM para la identificación de micoorganismos de interés clínico y los métodos de referencia, lo que afianza a este sistema como una buena alternativa en el trabajo diario como método de identificación de bacterias y hongos.
2.- El análisis proteómico mediante MALDI-TOF, tanto a través de la plataforma Vitek MS como con el sistema Biotyper, es una tecnología rápida y precisa para la identificación de especies del complejo ABC, mostrando una buena correlación con el ARDRA, considerado como el “gold estándard” para la identificación del complejo.
3.- El MALDI-TOF es una herramienta alternativa a la PCR del gen choE para la identificación y diferenciación de cepas de R. equi y Dietzia spp., aunque, como hemos visto, la composición de la pared de estos microorganismos siga marcando alguna limitación para la aplicación de esta técnica.
4.- En el caso de Candida spp. MALDI-TOF también es un sistema válido de identificación, con una alta sensibilidad y especificidad, proporcionando resultados con rapidez, lo que permite anticipar el diagnóstico respecto a los sistemas habituales de identificación. Es necesario mejorar las bases de datos, para poder discriminar entre C. albicans y C. dubliniensis.
5.- Para los géneros Acinetobacter y Rhodococcus el sistema Biotyper se ha mostrado superior que el sistema Vitek MS en la identificación a nivel de especie.
6.- Como conclusión global final, la tecnología MALDI-TOF es una buena metodología para la actividad rutinaria en laboratorios de microbiología clínica, ya que identifica una amplia gama de especies bacterianas y levaduras de importancia clínica, con rapidez y precisión.
Bibliografía consultada:
Básicamente se han hecho búsquedas masivas con el motor de búsqueda PubMed, que agrupa más de 32 millones de citas de literatura biomédica de MEDLINE, revistas biológicas y libros en línea.
- English
The identification of microorganisms has been one of the main tasks of the microbiologist over time. Mass spectrometry (MS) has entered laboratories strongly, in principle, for the identification of microorganisms. The aim of the thesis was to demonstrate that mass spectrometry MALDI-TOF is a reliable, fast and accurate technique that allows the identification at species level of most microorganisms present in clinically relevant human samples. so it can be used in the daily routine of a clinical microbiology laboratory as an alternative or complement to traditional techniques. To validate this hypothesis, the initial objective of evaluating the MALDI-TOF VITEK MSTM system (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) was set out in a collection of strains that included a variety of species representative of those most frequently isolated in our laboratory. The application of the technique to resolve the species-level identification of 3 groups of microorganisms was then evaluated: Acinetobacter baumannii complex (ACB), Rhodococcus equi/Dietzia spp. and Candida spp.. Finally, conclude that MALDI-TOF technology is a good methodology for routine activity in clinical microbiology laboratories, identifying a wide range of clinically important bacterial and yeast species, quickly and accurately.
- español
