Caracterización fenotípica y filogenia molecular de hongos extremófilos
- Autores: Ernesto Rodríguez Andrade
- Directores de la Tesis: Alberto Miguel Stchigel (dir. tes.), Josep Guarro Artigas (dir. tes.), José Francisco Cano Lira (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Rovira i Virgili ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Cabañes Saenz (presid.), José Manuel Guillamón Navarro (secret.), Dea García Hermoso (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad Rovira i Virgili
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
INTRODUCCIÓN.
Los hongos extremófilos son capaces de sobrevivir bajo condiciones ambientales que impiden la proliferación de la gran mayoría de organismos. Estos hongos prosperan en hábitats altamente “estresados”, sometidos a altas o bajas temperaturas, en condiciones de elevada acidez o alcalinidad, altas concentraciones de sales inorgánicas y de otras sustancias osmóticamente activas, de baja disponibilidad de agua, contaminados con solventes orgánicos, petróleo y sus derivados, metales pesados o radionúclidos, entre otros. Si bien los hongos extremófilos vienen siendo estudiados hace ya décadas desde diversos enfoques científicos (fisiología y metabolismo, adaptación estructural y funcional a los condicionantes ambientales, complejidad genética, taxonomía y relaciones evolutivas, etc.), todavía queda un gran potencial de taxones por descubrir, debido a que existen nichos ecológicos y sustratos cuya biota fúngica extremófila es poco conocida porque han sido poco estudiados, o lo han sido con herramientas poco apropiadas, o porque no han suscitado el adecuado interés. Entre los sustratos menos estudiados, y a pesar de su importancia económica, encontramos un edulcorante natural por excelencia: la miel. La miel está compuesta mayoritariamente por monosacáridos (dextrosa y fructosa) en una concentración no menor a 60 %. Debido a su naturaleza fisicoquímica, así como su origen biológico (producida por las abejas -Apis mellifera- a partir del néctar o de las secreciones de ciertas plantas), la miel puede ser un sustrato ideal para el estudio de hongos xerófilos y xerotolerantes. El vino, con una concentración de etanol de entre 7 y 14 % v/v y una marcada acidez por su contenido en ácidos orgánicos, es una bebida de gran interés económico, tanto por el volumen de producción como por su elevado valor agregado. Las características físico- químicas determinan que el vino sea una bebida difícilmente deteriorable por la mayoría de los microorganismos. A pesar de ello, existen unas pocas bacterias (productoras de los picado acético y láctico) y levaduras capaces (incluida el Saccharomyces cerevisiae, la levadura de cerveza) de crecer a sus expensas y favorecer su alteración, en especial cuando la concentración alcohólica es relativamente baja. A pesar de que existe un limitado número de reportes sobre la potencial implicación de hongos filamentosos en la alteración organoléptica de vinos por la producción metabolitos volátiles con gustos/olores desagradables tales como el 2,4,6-tricloroanisol (TCA), no se sabe si lo hacen a expensas de la alteración del vino o tan solo a expensas del tapón de corcho que sella las botellas. A pesar de que los ecosistemas antárticos han sido intensamente estudiados a lo largo de más de un siglo, el conocimiento sobre la diversidad de microbiana sigue incrementándose año tras año con la incorporación de nuevos taxones. En las últimas dos décadas ha resurgido el interés por el estudio de bacterias y hongos psicrófilos, debido al potencial uso biotecnológico de sus enzimas. Por otro lado, a pesar de que los hongos que producen infecciones severas en los seres humanos y animales son poco más de 50 especies, son cientos las especies fúngicas aislados de especímenes clínicos, algunas de los cuales han sido reportados como nuevos taxones para la ciencia. Muchos de estos hongos muestran como característica común su termotolerancia, pudiendo desarrollar a temperaturas de entre 35 y 37 oC. Entre dichos taxones, las especies del género Malbranchea han sido escasamente estudiadas como patógenos oportunistas humanos y animales. Finalmente, el suelo es uno de los reservorios más importantes en cuanto a biodiversidad fúngica. Además de ser un sustrato heterogéneo y extremadamente diverso en cuanto a sus características físicas y composición química y biológica, las fuentes de materia inorgánica y orgánica son transformadas y movilizadas continuamente por la actividad metabólica de los micro- y macro-organismos que lo habitan. También es importante la influencia que ejerce la climatología sobre sus poblaciones microbianas. Todos estos factores condicionan la consolidación de unas determinadas poblaciones fúngicas, mientras que otras son suprimidas. A pesar de lo extensivamente estudiado a lo largo de más de un siglo, el suelo continúa siendo una fuente de nuevos hongos para la ciencia.
OBJETIVO.
El objetivo general de la presente tesis doctoral es la de estudiar ciertos aspectos de la biología (mediante la caracterización de sus estructuras vegetativas y reproductivas, y de sus peculiaridades fisiológicas) y la evolución (mediante la reconstrucción de su filogenia basada en el análisis de las secuencias nucleotídicas de ciertos genes estructurales) de los hongos aislados de ambientes extremos y, a consecuencia de su estudio, esclarecer la relación evolutiva con otros individuos y su posición taxonómica.
METODOLOGÍA.
Aislamiento y obtención de cultivos puros de los hongos de interés: -Muestras de miel: se colocaron 10 g de miel en un recipiente de plástico estéril y se disolvieron en 90 mL de agua estéril. Posteriormente, 1 mL de cada dilución fue inoculada asépticamente junto con 15 mL de medio glicerol 18 % (G18) fundido a 50-55 ºC en placas Petri de 9-10 cm, y la mezcla se homogenizó por agitación manual rotatoria. Las placas fueron incubadas a 15 ºC y a 25 ºC durante 1 a 2 meses. De las colonias crecidas en dichas placas, se transfirió una cierta cantidad de masa fúngica a dos placas Petri (de 5 cm de diámetro), una conteniendo agar dextrosa patata (PDA) y otra G18, en las mismas condiciones de incubación que las descritas anteriormente.
-Muestras de vino (cava): se filtraron (a través de membranas de nitrocelulosa estériles de 0.45 micrómetros de diámetro de poro) 100 mL de muestra. Posteriormente, las membranas fueron colocadas asépticamente sobre la superficie del PDA contenido en placas de Petri de 9-10 cm de diámetro. Las condiciones de incubación y el procedimiento de aislamiento en cultivo puro fueron los mismos que los descritos anteriormente.
-Tapones de corcho: se cortaron con un bisturí estéril y los fragmentos (0.5 – 1.0 cm) fueron colocados sobre PDA (9-10 cm). Las condiciones de incubación y el procedimiento de aislamiento en cultivo puro fueron los mismos que los descritos anteriormente.
-Muestras de suelo: 1-2 g de suelo fueron introducidos en un tubo de ensayos estéril y se le adicionaron 5 mL de fenol al 2 % p/v, se homogenizaron mediante agitación y se dejaron reposar 10 min; posteriormente, se desechó el líquido sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 10 mL de agua destilada estéril, y se vertieron en volúmenes iguales en tres placas Petri (9-10 cm) y se mezclaron on 15 mL de agar con extracto de patata y zanahoria (PCA) y cloranfenicol (50 mg/L) fundido a 50-55 ºC, se homogenizó por agitación manual, y una vez gelificado el medio de cultivo, las places fueron incubades a 25 ºC y 35 ºC durante 2 a 6 semanas. El procedimiento de aislamiento en cultivo puro fue similar al descrito anteriormente.
Identificación microscópica presuntiva de los hongos de interés: -Se montaron preparaciones microscópicas con material procedente de las colonias fúngicas que mostraban la producción de -Se observaron las preparaciones al microscopio de campo claro a aumentos comprendidos entre X 400 y X 1.000, caracterizando, midiendo y documentando las estructuras vegetativas y reproductivas, tanto sexuales como asexuales, para intentar obtener una identificación presuntiva del hongo aislado mediante el empleo de literatura especializada.
Identificación molecular y filogenética: -Se extrajo el ADN genómico total de los hongos de interés usando un protocolo de extracción por medio de perlas de cristal, en el cual, a un tubo estéril con dichas perlas, se le agregó micelio estéril y un buffer de lisis (100 mM Tris pH 8.0; mM EDTA; 1 % SDS), posteriormente se trituró el micelio usando el FastPrep FP120 cell disrupter durante 45 segundos, seguido esto, se centrifugaron las muestras por 10 min a 13000 revoluciones por minuto (RPM), después se les agregó 275 μL de acetato de amonio pH 7.0, incubando las muestras a 65 ºC durante 5 minutos y después a 4 ºC por otros 5 minutos. Posteriormente se les agregó 500 μL de cloroformo y las muestras una vez más se centrifugaron durante 5 minutos a 13000 RPM. El sobrenadante fue recuperado en un tubo Eppendorf estéril y se les agregó 800 μL de isopropanol y se incubaron a 4 ºC durante 15 minutos. El ADN fue precipitado centrifugando los tubos una vez más durante 5 minutos a 13000 RPM, y fue lavado con etanol al 70 %. Finalmente, el ADN se dejó secar durante una hora y se resuspendió en agua grado miliQ, agregándole 2 μL de RNAsa (10 mg/mL), incubando las muestras durante 30 minutos a 37 ºC, para posteriormente ser congeladas a -20 ºC.
-Mediante el uso de cebadores específicos se realizó la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR) en un termociclador, para amplificar los marcadores moleculares, tales como la región ITS (ADNr), los dominios D1 y D2 del gen 28S del ARN ribosomal, o fragmentos de los genes de la β-tubulina, calmodulina y/o de la ARN polimerasa II (dependiendo del hongo, se amplificaron unos u otros marcadores).
-Los productos de la PCR se enviaron a secuenciar a Macrogen-Europa.
-Una vez obtenidas las secuencias, su comparación contra las de taxones previamente conocidos se realizó mediante el empleo del pairwise sequence alignment del Westerdijk Institute (http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/), y del BLAST search del NCBI-NIH (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/). Para la identificación presuntiva de los aislados de interés a nivel de especie, se consideraron aquellas provenientes de cepas tipo o de referencia de colecciones internacionales de cultivos microbianos, cuyas secuencias mostraron una identidad ≥ 98% y una cobertura ≥ 99%. Resultados inferiores a los anteriormente mencionados se consideraron para una identificación parcial, a nivel género, familia u orden, según correspondía.
-En el análisis filogenético se utilizaron dos métodos: inferencia bayesiana (BI) y máxima verosimilitud (ML). Los análisis se realizaron de forma individual o mediante combinación de diferentes genes (análisis concatenado) cuando era posible. Se utilizaron en los mismos tanto las secuencias obtenidas en nuestros estudios como otras procedentes de estudios previos y depositadas en las bases de datos anteriormente citadas, preferentemente el GenBank-EMBL (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) así como otras disponibles en el TreeBASE (www.treebase.org).
CONCLUSIONES.
En la presente tesis doctoral se realizaron estudios polifásicos (morfológico, fisiológico y de filogenia molecular) a diversos aislados fúngicos obtenidos a partir de diversos sustratos y ambientes considerados como extremos para la mayoría de formas de vida: mieles (con una extremadamente baja aw y una elevada pOsm); vino espumoso (con un pH alrededor de 4,0, casi sin azúcares residuales, con una concentración alcohólica cercana a 11,5 % v/v, y sometido a una elevadísima pCO2)/tapones de corcho que sellaban las botellas; suelos antárticos (sometidos a largos períodos de tiempo a temperaturas bajo cero y una extrema desecación, seguido de breves períodos con temperaturas hasta los +11 ºC y HRA cercanas a 100% ); biopelículas polimicrobianas sobre superficies metálicas (aleaciones de zinc e hierro), concreto y cemento (pH alcalinos, por encima de 8,5) y pinturas sintéticas en una nave industrial y viviendas vecinas (todas superficies sometidas a irradiación solar durante varias horas/día, a una extrema desecación debido a los vientos dominantes de la zona, y a xenobióticos producidos por la industria); y especímenes clínicos procedentes de pacientes de todo USA y de diversas localizaciones anatómicas (mayoritariamente sometidos a una temperatura constante de 35-37 ºC y una pO2 reducida). En el caso de los aislados de origen clínico, se realizó además un estudio de sensibilidad in vitro frente a las drogas antifúngicas más comúnmente empleadas en terapéutica humana. Como resultados de dichos estudios: -El empleo del medio de cultivo G18 ha permitido aislar una gran diversidad de hongos xerófilos y xerotolerantes, demostrando así que la miel es un hábitat poco explorado en cuanto a la diversidad fúngica. Un total de 104 cepas fúngicas han sido aisladas a partir de 83 muestras de miel de España (y de una procedente de Argentina), las que fueron distribuidas en 32 especies de los géneros Alternaria, Ascosphaera, Aspergillus, Bettsia, Candida, Cunninghamella, Eremascus, Helicoarthrosporum, Monascus, Mucor, Oidiodendron, Penicillium, Rhizopus, Schizosaccharomyces, Skoua, Strongyloarthrosporum, Talaromyces, Xerochrysium y Zygosaccharomyces.
-A partir de las muestras de vino espumoso “cava” y tapones de corcho que sellaban las botellas, fueron aisladas un total de 27 cepas fúngicas, las que fueron distribuidas en 16 especies en los siguientes géneros: Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Candida, Cladophialophora, Cladosporium, Digitodendron, Kirschsteiniothelia, Penicillium, Rasamsonia y Talaromyces. La presencia de estos hongos en las muestras de “cava” con alteración organoléptica compatibles con “cork taint” y en los tapones de corcho que sellaban las botellas tienen, muy probablemente, origen en el ambiente de la bodega donde los vinos sufren el proceso de fermentación secundaria y envejecimiento. Ninguna de las especies fúngicas recuperadas de dichos sustratos fue capaz de crecer a concentraciones de etanol similares a las del vino espumoso en estudio (aprox. 11,5 % v/v), pero mantuvieron su viabilidad a dichas concentraciones alcohólicas, de acidez fija y de elevadas presiones de CO2 generadas dentro de las botellas. Sin embargo, queda por evaluar la capacidad de dichos hongos de producir el TCA y/u otros compuestos volátiles orgánicos involucrados en la producción del “cork taint” detectado en las muestras de vino.
-La caracterización fenotípica y el estudio de filogenia molecular de las 22 cepas de origen clínico procedentes de USA y las cuales habían sido identificadas presuntivamente como pertenecientes al género-forma Malbranchea, permitió asignar varias de ellas a los géneros Arachnomyces (2 cepas), Currahmyces (1 cepa), Malbranchea (15 cepas) y Spiromastigoides (2 cepas). Debido a que las 22 cepas fueron capaces de crecer por encima de los 30 ºC, 20 de estas pudieron hacerlo a los 35 ºC, y una hasta los 40 ºC, se ha demostrado su termotolerancia. Con respecto al estudio de sensibilidad in vitro de estos hongos, las equinocandinas (AFG, MFG y CFG) mostraron tener la mayor actividad antifúngica, seguida de la TRB y el PSC. Por el contrario, la AMB, la FLC, el ITC y la 5-FC mostraron tener una baja o nula actividad sobre estos hongos.
De los aislados del género Penicillium procedentes de muestras de suelo de México y España, después de su estudio taxonómico polifásico, cuatro resultaron pertenecer a nuevas especies para la ciencia: Penicillium melanosporum Rodr.-Andr., Cano & Stchigel, Penicillium michoacanense Rodr.-Andr., Cano & Stchigel, Penicillium sexualis Rodr.-Andr., Cano & Stchigel y
