Caracterización del papel de la hipoxia en senescencia y cómo su alteración contribuye a la inmortalización celular y la tumorigénesis

• Autores: Daniel Otero Albiol
• Directores de la Tesis: Amancio Carnero (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Número de páginas: 155
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  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • La senescencia celular es un estado fisiológico complejo de las células caracterizado por la parada proliferativa, los cambios en la estructura de la cromatina, modificaciones epigenéticas específicas, cambios metabólicos, alta actividad β-galactosidasa ácida, un fenotipo de secreción aumentada, además de la alteración de orgánulos, entre otras características fenotípicas. La senescencia celular puede ser inducida a través de diferentes mecanismos intrínsecos y extrínsecos como el acortamiento telomérico y la respuesta a daño en el ADN, la detección de señales oncogénicas, el estrés oxidativo o el tratamiento con terapias contra el cáncer. La senescencia es necesaria en la regulación de diversos procesos fisiológicos como la supresión tumoral, el desarrollo de estructuras del embrión, la cicatrización de tejidos y la reprogramación celular implicada en la regeneración tisular. Además, la aparición de células senescentes correlaciona con el envejecimiento de los tejidos y está implicada en los efectos deletéreos de patologías asociadas a él. A pesar de la relevancia fisiológica de la senescencia, se desconoce cómo la hipoxia, que es característica en todos los tejidos del organismo, modula su iniciación y desarrollo. De este modo, no está claro si la hipoxia actúa como un estrés que induce senescencia, o bien, se trata de un estímulo capaz de promover la proliferación y la inmortalización previa a la transformación maligna. Existen múltiples evidencias de la contribución de la hipoxia a la malignidad tumoral. Además, la hipoxia promueve el mantenimiento de la pluripotencia y la autorrenovación tanto de células madre embrionarias (ESCs) como de células madre adultas, células pluriputentes inducidas (iPSCs) y células madre tumorales (CSCs). Por tanto, decidimos estudiar el efecto de la hipoxia sobre la senescencia y la inmortalización celular y su posible contribución a la tumorigénesis. Hemos comparado la vida proliferativa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) cultivados en hipoxia (3% O2) con la de MEFs cultivados en normoxia (20% O2). Los MEFs prolongan su vida proliferativa si se cultivan en hipoxia desde el explante del embrión, mientras que aquellos que crecen en normoxia cesan la proliferación y muestran características senescentes tras 30 días de en un protocolo 3T3. Los MEFs de hipoxia presentan menor expresión de p21Cip1, p15INK4b y p16INK4a. Aunque poseen signos de estrés proliferativo en hipoxia, con altos niveles de p-H2AX (Ser139) y p-p53 (Ser15), esto no desemboca en parada proliferativa a través de la activación de p53. Estos MEFs se mantienen en cultivo ininterrumpido en hipoxia al menos durante 6 meses. Ante las evidencias de la hipoxia como un factor que promueve la autorrenovación y la pluripotencia en células madre, hemos encontrado una mayor expresión de genes de desdiferenciación y relacionados con las propiedades de células madre en las muestras de hipoxia, entre los que destacan Oct3/4, Sox2, Sox9, Klf2, Klf4, c-Myc, Bmi1 y Nanog. Además, en las muestras inmortalizadas en hipoxia, se sobreexpresa Tfcp2l1, un regulador central de la pluripotencia y la autorrenovación de ESCs. La variación de los niveles de expresión de Tfcp2l1 puede provocar la entrada en senescencia. En el caso de la disminución de la expresión, el uso de shARNs contra el ARNm de Tfcp2l1 provoca la entrada en senescencia con parada proliferativa, alta expresión de p16INK4a y alta actividad β-galactosidasa ácida tanto en normoxia como en hipoxia. En el caso de la expresión ectópica de muy altos niveles de Tfcp2l1, se produce entrada en senescencia con alta actividad β-galactosidasa ácida, además de un aumento de la expresión de p16INK4a, p21Cip1 y, al mismo tiempo, sobreexpresión de los factores de Yamanaka Oct3/4, Sox2 y Klf4. Esto sugiere que la senescencia inducida por altos niveles de Tfcp2l1 es similar a la inducida por oncogenes (OIS) o por reprogramación (RIS). Sólo cuando se expresan ectópicamente en normoxia, niveles de Tfcp2l1 similares a los fisiológicos inducidos por la hipoxia, se consigue aumentar la vida proliferativa de los MEFs. El incremento y mantenimiento de expresión de Tfcp2l1 en hipoxia está inducido, muy probablemente, por la unión de Hif1α a un “enhancer” cercano a Tfcp2l1 en el ADN. Esto lo hemos comprobado simulando hipoxia en normoxia con inhibidores de las PHDs, con la expresión ectópica de un mutante de activación constitutiva de Hif1α en normoxia y mediante el estudio de las zonas reguladoras asociadas a Tfcp2l1 en el genoma. Además de incrementar la expresión de Tfcp2l1, la hipoxia promueve una mayor actividad de Tfcp2l1 como factor transcripcional. Hemos realizado ChIP-Seq de Tfcp2l1 en células de normoxia y de hipoxia y hemos observado que se une a un mayor número de secuencias asociadas a genes en el ADN. En concreto, Tfcp2l1 promueve la expresión de genes reguladores de la proliferación que, en muchos casos, también están relacionados con las propiedades de células madre, como son Sox2, Sox9 y Tgfa. La capacidad de Tfcp2l1 de promover la proliferación y la pluripotencia también es relevante en la reprogramación. Hemos comprobado el papel causal de Tfcp2l1 en el incremento de la eficiencia de reprogramación causada por la hipoxia. La expresión ectópica de Tfcp2l1 en normoxia incrementa el número de colonias iPSCs al igual que la hipoxia. Además, la disminución de su expresión en hipoxia mediante shARNs disminuye el número de colonias generadas. Además, la expresión de Tfcp2l1 correlaciona positivamente con la expresión de Nanog en iPSCs generadas en hipoxia y en normoxia, y negativamente con la de p21Cip1 y p16INK4a. Nuestros datos sugieren que la activación de Tfcp2l1 por la hipoxia podría ser relevante en la inmortalización previa a la transformación maligna, facilitando la tumorigénesis. Además, en el microambiente tumoral, que es hipóxico, la expresión de Tfcp2l1 podría favorecer la aparición de CSCs al promover la pluripotencia y, por tanto, la desdiferenciación celular.