Identificación de proteínas que interaccionan con el extremo N-Terminal del factor de transcripción hipofisario GHF-1/PIT-1
- Autores: Yadira Díaz Gallardo
- Directores de la Tesis: José Luis Castrillo Díez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2002
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ana Aranda Iriarte (presid.), Francisco Zafra (secret.), Antonio Talavera Díaz (voc.), José Fernández Piqueras (voc.), Pedro Esbrit Argüelles (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El factor de transcripción GHF-1/Pit-1 regula el desarrollo y la expresión génica en tejido hipofisario. Este factor se caracteriza por tener tres dominios estructurales: un dominio transactivador y dos dominios de unión al ADN. La proteína Pit-1 se expresa en el lóbulo anterior de la glándula pituitaria durante todo la vida, y solamente en sistema nervioso central en etapas fetales. GHF-1 regula la expresión de los genes hipofisario GH, PRL y TSH beta.
El objetivo principal de este trabajo fue identificar proteínas co-reguladoras que interaccionen con el factor de transcripción GHF-1. Para ello, se construyeron dos genotecas de gran calidad de ADNc de una línea celular hipofisaria, una fenoteca en fago, y la otra en vectores de expresión en levaduras.
Se seleccionaron tres regiones del extremo N-terminal del factor transcripcional GHF-1 para utilizarse como proteína señuelo en el ensayo del doble híbrido en levaduras. Se identificaron más de 1600 clones positivos que interaccionan con algún subdominio de GHF-1 mediante el ensayo del doble híbrido. Se confirmó la interacción proteica in vivo entre las proteínas utilizadas como señuelo y las proteínas aisladas de las genotecas de 180 clones positivos.
Se eliminaron clones repetidos e incompletos mediante los patrones de restricción enzimática. Posteriormente, se secuenciaron los clones positivos, y con la ayuda de programas presentes en internet se analizaron tanto las secuencias nucleotidicas como aminoacídicas de las proteínas aisladas por el ensayo del doble híbrido.
Las proteínas aisladas fueron expresadas in vitro y, a continuación, se confirmó la interacción proteica in vitro e in vivo entre las regiones señuelo de GHF-1 y las proteínas aisladas de las genotecas de hipófisis y de cerebro.
Mediante la técnica del doble híbrido, identificamos diversas proteínas que interaccionan con las regiones STA, CHG y STA/CHG de GFH-1, que no habían s
