Resumen de Genetic dissection of type iii secretion system regulation in pseudomonas syringae pv. Phaseolicola
Pseudomonas syringae es una bacteria fItopatógena Gram-negativa ampliamente extendida en la naturaleza, capaz de colonizar una gran variedad de hospedadores. P. syringae es responsable de la inducción, en plantas resistentes, de una respuesta localizada de muerte celular programada, que determina el fallo de la infección (HR), así como de la patogénesis en plantas susceptibles. En estos procesos participan diversos factores de virulencia entre los que se incluye el sistema de secreción tipo III (T3SS). El análisis molecular de la contribución de cada factor en el proceso de virulencia, así como de las relaciones funcionales que existen entre ellos, es esencial para comprender la patogénesis de P. syringae. Con frecuencia, el estudio de la función de un gen en un proceso tan complejo, como es el proceso de infección, requiere del análisis genético de mutantes múltiples, y el método de intercambio alélico es el más utilizado en bacterias para obtener dichas estirpes. En Pseudomonas y en otras bacterias no entéricas, este método resulta muy lento y laborioso, ya que, para generar mutantes múltiples, cada plásmido suicida utilizado en la obtención de un mutante sencillo por intercambio alélico, se ha de construir empleando distintos marcadores de resistencia a antibióticos, con el fin de poder hacer todas las posibles doble o múltiples combinaciones de mutantes sobre el mismo fondo genético. En este trabajo, hemos llevado a cabo una modificación del método para acelerar todo el proceso de generación de mutantes múltiples, el cual implica la utilización de plásmidos derivados del vector suicida pKAS32. Para validar el método generamos diferentes combinaciones de mutaciones en genes del sistema de secreción tipo III en P. syringae. Y además comprobamos la estabilidad y organización genética de las estirpes obtenidas cuando crecen en cultivo in vitro o en la planta.
Los T3SSs son sistemas de secreción complejos y especializados que se componen de aproximadamente 20 proteínas codificadas en el locus hrp/hrc (hypersensitive response and pathogenesis/ hypersensitive response conserved). Los genes hrp/hrc se organizan en operones que pueden localizarse tanto en un plásmido como en el cromosoma bacteriano. La expresión del T3SS se induce en la planta en respuesta a factores medioambientales o propios del hospedador. En este proceso participan cuatro activadores transcripcionales: HrpR y HrpS, que constituyen un sistema de regulación de dos componentes del tipo NtrC, que activa la expresión de HrpL, un factor a alternativo que, junto con el factor ¿54 o RpoN, activa la expresión de los genes hrp/hrc. Adicionalmente, la proteína HrpA, que es la unidad estructural del pilus Hrp, ha sido identificada como necesaria para la expresión de los genes hrpR/S. Por otra parte, se ha descrito que la expresión de los genes hrp/hrc está regulada negativamente por la proteasa Lon en medio rico, y por HrpV en condiciones de inducción. HrpV se une a HrpS y a HrpG. Este último actúa como un supresor de la represión ejercida por HrpV sobre la expresión de los genes hrp/hrc. Las funciones reguladoras de estas proteínas se han identificado en diferentes patovares usando condiciones de inducción in vitro y aplicando una metodología variada.
En esta tesis, examinamos el papel que desempeñan HrpL, GacA, HrpA, Lon y HrpV en la patogénesis de P. syringae pv phaseolicola (Pph), analizando de la expresión in vitro e in planta mediante el uso de PCR a tiempo real, índices de competitividad y otros ensayos, en mutantes sencillos y dobles, y en estirpes que expresan ectópicamente estos reguladores. Nuestros resultados indican: (i) HrpL actúa como un regulador general en la virulencia de Pph, que también activa determinantes de virulencia independientes del T3SS y reprime la función flagelar, (¡i) GacA modula la expresión de hrpL y su contribución en virulencia es totalmente dependiente de HrpL, (iii) en medio rico existe una expresión basal de los genes hrp/hrc independiente de HrpL cuya función puede ser la de mantener el sistema preparado para ser activado rápidamente tras el contacto con la planta, (iv) HrpA regula positivamente la expresión de los genes hrp/hm y es esencial para la inducción de la expresión del operón hrpZ, (v) Lon regula negativamente la expresión de los genes hrp/hrc en todas las condiciones, probablemente degradando la proteína HrpR, (vi) HrpV reprime la expresión del T3SS en todas las condiciones, (vii) HrpT contribuye en la regulación negativa de la expresión de los genes hrp/hrc, y (viii) HrpG posee un papel en la regulación de la expresión del operón hrpC que es independiente de HrpV. Finalmente, discutimos la implicación biológica de estos resultados y proponemos un modelo de regulación del sistema teniendo en cuenta las distintas condiciones en las que la bacteria se encuentra.
