Proteins influencing the septal junctions in heterocystous cyanobacteria

• Autores: Sergio Arévalo Díaz
• Directores de la Tesis: Enrique Flores García (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Número de páginas: 187
• Tribunal Calificador de la Tesis: Agustín Vioque Peña (presid.), José Román Pérez Castiñeira (secret.), Antonia Herrero Moreno (voc.), Damien P. Devos (voc.), Diana Kirilovsky (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • La multicelularidad es una forma de organización biológica que ha aparecido de forma independiente en muchos grupos filogenéticos a lo largo de la evolución. En los organismos multicelulares se dan universalmente procesos de adhesión, comunicación y diferenciación celular. La multicelularidad se observa en varios grupos bacterianos, estando las cianobacterias entre los organismos multicelulares más antiguos de la Tierra. Las cianobacterias se caracterizan por llevar a cabo la fotosíntesis oxigénica, mediante la cual se produce la liberación de oxígeno y la producción de “poder asimilatorio” (ATP y ferredoxina reducida/NADPH), el cual se usa en la fijación de CO2 atmosférico y en la asimilación de algunos otros nutrientes oxidados. Dentro de este filo se pueden encontrar tanto organismos unicelulares como multicelulares. Aquellas cianobacterias que se comportan como organismos multicelulares crecen formando filamentos, y en condiciones de deficiencia de nitrógeno algunas de ellas pueden dar lugar a un proceso de diferenciación celular produciendo un tipo celular llamado heterocisto. Este último lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico (N2), mientras que el resto de las células del filamento, denominadas células vegetativas, continúan con la fijación de CO2. Otras especies del filo tienen la capacidad de formar aquinetos, que son una forma celular de resistencia que aparece en algunas cianobacterias cuando las condiciones ambientales se vuelven adversas, y aún otras forman hormogonios, pequeños filamentos móviles con una función de dispersión. Este trabajo se ha realizado con la estirpe modelo Anabaena sp. PCC 7120, que es una cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos. Las cianobacterias poseen una envuelta celular de tipo Gram negativa, y en las cianobacterias filamentosas la membrana plasmática envuelve individualmente a cada célula mientras que la membrana externa, situada por fuera de la capa de peptidoglicano, es continua definiendo por tanto un periplasma continuo. Cuando Anabaena crece en ausencia de nitrógeno combinado, se produce la diferenciación de heterocistos, formándose un patrón a lo largo del filamento de un heterocisto cada 10-15 células vegetativas. El crecimiento diazotrófico exige una comunicación intercelular que permita el intercambio de nutrientes y moléculas reguladoras de la diferenciación a lo largo del filamento, llevándose a cabo esta comunicación a través de los nexos septales. Estos son unas estructuras proteicas que comunican de forma directa las células adyacentes. Actualmente se conocen algunas proteínas que forman parte de los nexos septales como son FraC y FraD, y algunas otras que son esenciales para el correcto funcionamiento o ensamblaje de los mismos, como son SepJ, SepI, HglK (demostrada en esta Tesis) o FraE. Para el ensamblaje de los nexos septales es necesario una perforación del peptidoglicano existente entre las células adyacentes del filamento. Estas perforaciones reciben el nombre de nanoporos y se encuentran en el disco septal de peptidoglicano. En la primera parte de este trabajo se intentó establecer una relación entre los nanoporos y la comunicación intercelular mediada por los nexos septales, utilizando como herramientas un marcador fluorescente y diferentes mutantes de Anabaena. El marcador fluorescente utilizado fue la calceína, que posee la propiedad de difundir desde el exterior hasta el interior de la célula, donde sufre un proceso de hidrólisis que le impide volver a atravesar la membrana plasmática, quedando atrapada en el interior de la célula y emitiendo fluorescencia. Por medio de experimentos de FRAP (“Fluorescence Recovery After Photobleaching”) se pudo calcular un indicador cuantitativo de transferencia entre células adyacentes del filamento. Por otra parte, mediante el aislamiento del peptidoglicano y su visualización por microscopía electrónica de transmisión se pudo cuantificar el número de nanoporos de las estirpes estudiadas. Estos ensayos se realizaron en filamentos (cultivados en presencia o ausencia de nitrógeno combinado) de la estirpe silvestre y de mutantes tanto de proteínas que intervienen en la formación de los nexos septales como de proteínas que influyen en su ensamblaje y funcionamiento. Los resultados obtenidos permitieron establecer una correlación entre el número de nanoporos y la transferencia intercelular de calceína en filamentos que habían sido incubados en medio sin nitrógeno combinado, pero no en aquellos incubados en presencia de nitrógeno, en los que se observaba una elevada proporción de células no comunicantes. En la segunda parte de esta Tesis se procedió a la caracterización de la proteína HglK, que pertenece a la familia de las pentapeptide repeat proteins (PRP). HglK se compone de cuatro segmentos transmembrana en su mitad N-terminal y de una sección soluble de localización periplásmica que contiene el dominio PRP en su mitad C-terminal. Estudios previos de HglK mostraron que mutantes que carecían de ella eran incapaces de crecer diazotróficamente y tenían un espacio incrementado entre las células del filamento. En esta Tesis se abordó la localización de HglK en estirpes de Anabaena que producían HglK fusionada a la superfolder-GFP (sfGFP) o con una cola de histidinas o con la etiqueta molecular Strep II. Mediante microscopía confocal y de fluorescencia y ensayos de inmunolocalización, se pudo establecer que HglK poseía una localización preferentemente polar en las células de Anabaena. El estudio de mutantes hglK determinó que HglK es necesaria para la integridad del filamento y para observar unos niveles normales de intercambio molecular entre las células vegetativas del filamento. Sin embargo, los experimentos realizados con mutantes de HglK y de otras proteínas septales mostraron que ni la fragmentación de los filamentos ni la alteración en el intercambio molecular era mayor cuando se combinaba la inactivación de HglK con la de otras proteínas septales. En la caracterización de HglK también se pudo establecer que el fenotipo de crecimiento diazotrófico negativo del mutante hglK estaba determinado por su incapacidad de fijar nitrógeno atmosférico como consecuencia de un defecto en la expresión génica durante la diferenciación de los heterocistos, puesto de manifiesto como una expresión disminuida de los genes del operón cox2 (citocromo oxidasa del heterocisto) y nifHDK (nitrogenasa) en los mutantes hglK. Los avances obtenidos mediante la caracterización de HglK y el conocimiento disponible sobre la proteína SepJ, ponían de manifiesto la implicación de ambas proteínas en los nexos septales. SepJ es una proteína integral de membrana con una localización focalizada en el centro del septo intercelular. SepJ está compuesta por una permeasa en su parte C-terminal y por un linker (rico en el amino ácido prolina) y un dominio coiled-coil en su parte N-terminal, la cual parece ser periplásmica. En el tercer capítulo de esta Tesis se intentó identificar proteínas con las que pudieran tener algún tipo de interacción tanto HglK como SepJ. El abordaje experimental se hizo mediante el uso de estirpes de Anabaena que portaban HglK fusionada a la Strep II o SepJ fusionada a la Strep II o a la GFP. Estas fusiones permitieron la purificación de las proteínas, que se llevó a cabo bajo condiciones no desnaturalizantes, intentando evitar la disgregación de los posibles complejos que pudieran formar con otras proteínas. Las muestras obtenidas tras las purificaciones se analizaron por espectrometría de masas para identificar todas las proteínas presentes en ellas. El análisis de los resultados mostró varias proteínas que podrían interactuar con HglK o SepJ. El primer resultado destacable es la posible interacción entre ambas (SepJ y HglK), aunque la co-purificación de las dos proteínas solamente se observó en los aislados de SepJ. También destaca la presencia de dos proteínas comunes en los aislados de SepJ y HglK. Estas proteínas son Alr2937 y Tic22 (Alr0114), ambas periplásmicas, la segunda de las cuales con un papel importante en la formación de la membrana externa de Anabaena. Finalmente, mientras que no se ha encontrado ninguna proteína que interaccione solamente con HglK, para SepJ se detectó Alr1690, una proteína anclada a la membrana plasmática que presenta dominios periplásmicos de unión al peptidoglicano. Continuando con el estudio de las proteínas septales, se quiso profundizar en el conocimiento de las proteínas SepJ, FraC y FraD de otras cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, concretamente de cianobacterias simbióticas con diatomeas marinas. En el cuarto capítulo de esta Tesis, se estudiaron estas proteínas septales codificadas por los genes de las cianobacterias Richelia intracellularis (RintHH01) y Calothrix rhizosoleniae (CalSC01). R. intracellularis es un endosimbionte obligado que vive en el citoplasma de la diatomea Hemiaulus hauckii, mientras que C. rhizosoleniae es un exosimbionte facultativo de la diatomea Chaetoceros compressus, pudiendo proliferar anclada extracelularmente a la diatomea o como un organismo de vida libre. En Anabaena, fraC y fraD forman parte del operón fraCDE que también se encuentra presente en CalSC01 y, sólo fraCD, en RintHH01. Respecto a SepJ, tanto RintHH01 como CalSC01 contienen genes que determinan proteínas homólogas a la de Anabaena. Los mutantes sepJ y fraC-fraD de Anabaena muestran un fuerte fenotipo de fragmentación e imposibilidad de crecer diazotróficamente, ambos fenotipos de fácil estudio, por lo que se intentó la complementación de dichos mutantes con los genes de las cianobacterias simbióticas. Los genes sepJ y fraCD de RintHH01 y los genes sepJ y fraCDE de CalSC01 se obtuvieron por síntesis química, en el caso de sepJ de CalSC01 con un uso de codones adaptado a Anabaena, para ser introducidos en mutantes de Anabaena que portaban las deleciones sepJ (estirpe CSVM34) o fraC-fraD (estirpe CSVT22), respectivamente. La complementación de CSVM34 con sepJ de RintHH01 y de CalSC01 se hizo de forma que la expresión de estos tenía lugar desde el promotor natural del sepJ de Anabaena. Sin embargo, ni la complementación con sepJ de RintHH01 ni la realizada con sepJ de CalSC01 consiguieron revertir el fenotipo mutante, ni siquiera parcialmente. En cambio, sí se consiguió revertir al fenotipo silvestre cuando el mutante se complementó con sepJ de la propia Anabaena utilizado como control positivo. Por otro lado, los genes fraC-fraD de RintHH01 se transfirieron a la estirpe CSVT22 con dos estrategias distintas: en una su expresión tenía lugar desde el promotor natural fraC de Anabaena, y en otra la expresión tenía lugar desde el promotor glnA (promotor de fuerte expresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno) insertado en un plásmido replicativo de Anabaena. Por su parte, la complementación de CSVT22 con los genes fraC-fraD-fraE de CalSC01 solamente se intentó con expresión desde el promotor glnA en un plásmido replicativo. Nuevamente ninguna de las complementaciones abordadas tuvo éxito. Es más, las expresiones génicas realizadas bajo el promotor glnA causaban efectos perjudiciales para Anabaena, como pudimos comprobar con controles utilizando los propios genes de Anabaena, lo que sugiere que quizás no habíamos expresado los distintos genes en sus niveles óptimos de funcionalidad. La última parte de esta Tesis se dedicó a la realización de un breve estudio de la proteína FraE, siendo esta la otra proteína codificada en el operon fraC-fraD-fraE de Anabaena. FraE es una proteína de membrana necesaria para la integridad del filamento. En este capítulo se estudió su localización, para lo que se construyó una estirpe de Anabaena que producía FraE-sfGFP. Los ensayos de análisis de fluorescencia de la GFP llevados a cabo con esta estirpe pusieron de manifiesto que FraE se localiza principalmente en los polos de los heterocistos y que sus niveles disminuyen a las 48 horas de inducción en un medio sin nitrógeno combinado.