Localización, separación e identificación del complejo nad(p)h deshidrogenasa de los cloroplastos de cebada(hordeum vulgare l.)

• Autores: Araceli Garcia Buendia
• Directores de la Tesis: Juan Cuello Moreno (dir. tes.), María José de Jesús Quiles Ródenas (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2001
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Romualdo Muñoz Giron (presid.), Alfonso Ros Barceló (secret.), Francisca Sevilla Valenzuela (voc.), Ramón Madrid Vicente (voc.), José Egea Caballero (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología vegetal (botánica)
      • Fisiología vegetal
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• Resumen

  • Con el proposito de localizar, aislar e identificar el complejo NAD(P)H deshidrogenasa (NAD(P)H DH) de los cloroplastos de cebada, se partió de tilacoides estromales obtenidos por dos metodos de fraccionamiento. Uno basado en la solubilización de las membranas tilacoidales con el detergente digitonina y el otro en el tratamiento fisico de las mismas con ultrasonidos o sonicación.

    El estudio de las fracciones obtenidas, mediante parametros quimicos y bioquimicos,nos permitió comprobar la pureza de las muestras asi como la localizacion preferente en los tilacoides estromales del complejo objeto de estudio.

    Para aislar el complejo a partir de la muestra de tilacoides estromales, utilizamos la electroforesis nativa con Triton X-100 y posterior tinción con NADH y nitroazul de tetrazolio(NADH-NBT), obteniendo tres bandas con actividad NADH-NBTR(bandas 1,2 y 3). La obtención de tres bandas nos llevó a pensar que el complejo se disociaba durante la electroforesis. A continuación las bandas se electroeluyeron con el fin de obtener los perfiles polipeptidicos para su analisis por inmunotransferencia. El análisis con el anticuerpo anti-NdhA permitió identificar la enzima electroeluida de la banda 2, como el complejo NADH DH tilacoidal. Tambian se comprobó la asociación del complejo a la enzima FNR utilizando el anticuerpo fabricado contra FNR de cebada.

    Para intentar resolver el problema de la disociación del complejo, utilizamos para su aislamiento la electroforesis nativa con azul Coomassie(BN-PAGE) partiendo de tilacoides estromales obtenidos con sonicación. Despues de la electroforesis y tinción con NAD(P)H-NBT, se obtuvo una sola banda con actividad que se analizo por inmunotransferencia con los anticuerpos anti-NdhA,anti-NdhH y anti-polipeptido de 51 kDa, identificandola como el complejo NAD(P)H DH cloroplastico. Antes descartamos posibles contaminaciones por el complejo ATP sintetasa y la enzima rubisCo.

    Una vez aislado