Resumen de Análisis transcriptómico comparativo de "Porphyromonas gingivalis" ATCC 33277 en diferentes estados fenotípicos
Porphyromonas gingivalis, es una especie bacteriana con fuerte evidencia de asociación con la periodontitis. Puede presentarse como células que flotan libremente (planctónicas) u organizándose en estructuras tridimensionales de comunidades multimicrobianas llamadas biofilms que se unen a las superficies orales.
Se conoce muy poco acerca de su expresión génica global y de cómo puede variar según su estado fenotípico, desarrollando mecanismos más patogénicos en estado de biofilm, o por su asociación a otras bacterias, adaptándose a la vida en comunidad a través de patrones de regulación génica.
El objetivo general de esta tesis es determinar y comparar los cambios de expresión génica global de P. gingivalis ATCC 33277, mediante análisis transcriptómico en diferentes estados fenotípicos in vitro.
Se comparó la expresión génica global, de la bacteria en estado planctónico puro (condición control) con otras tres situaciones fenotípicas, de creciente complejidad: 1) Condición planctónica de P. gingivalis en presencia de un biofilm monoespecie, 2) Condición sésil de P. gingivalis en biofilm monoespecie y 3) Condición sésil de P. gingivalis junto con otras cinco especies formando un biofilm multiespecie (Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans y P. gingivalis).
Los cultivos de cada condición se incubaron en un modelo estático de crecimiento in vitro en placas multipocillo a 37ºC, durante 96h y en anaerobiosis, desarrollándose los biofilms sobre discos de hidroxiapatita de calcio cerámica.
Para verificar el progreso del estado planctónico a biofilm y la inclusión de P. gingivalis en él, se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía láser confocal de barrido (CLSM).
Después de la incubación, se recogieron las células de cada condición, se extrajo el ARN total y se transformó en ADNc. Tres réplicas biológicas para cada estado celular se hibridaron de forma independiente para la comparación transcriptómica, aplicando la tecnología de microarrays.
Para el análisis de datos se utilizó el software LIMMA, con un valor de p menor a 0,05 y un criterio de filtro de los resultados superior a 1,5 veces la expresión del control para el estudio de las dos condiciones planctónicas y superior a 2 veces para el estudio de expresión diferencial en los biofilms, comparado con el control.
La expresión diferencial fue confirmada por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-qPCR).
Como resultados se obtuvo: 1) Un 1,5% de los genes (29/1909) de P. gingivalis diferencialmente expresados en las células planctónicas en presencia de biofilm. Los genes encontrados se relacionaron principalmente con el metabolismo del hierro, la adhesión bacteriana, invasión o virulencia. 2) Un 4,8% de los genes de P. gingivalis (92/1.909) diferencialmente expresados en el biofilm monoespecie. De ellos, 54 fueron sobreexpresados, principalmente relacionados con la envoltura celular, el transporte y proteínas de unión o proteínas de membrana externa y 38 reprimidos, destacando las transposasas o genes implicados en el estrés oxidativo. 3) Un 19,1% de los genes (365/1.909) diferencialmente expresados cuando P. gingivalis crecía en el biofilm multiespecie (165 genes sobreexpresados y 200 reprimidos). Estos genes estaban involucrados principalmente en funciones relacionadas con el estrés oxidativo, la envoltura celular, los transposones y el metabolismo.
Este trabajo proporciona una visión de los cambios transcripcionales de P. gingivalis en la progresión de la complejidad de su fenotipo para adaptarse al estilo de vida de una comunidad y al interaccionar con otras especies bacterianas, facilitando información relevante para entender mejor la formación del biofilm, desarrollar estrategias para poder desorganizarlo y que sea más susceptible de ser atacado, pudiendo ayudar a la prevención del desarrollo de enfermedades periodontales.
