Physiological and pharmacological modulation of kv7 channels

• Autores: Alicia de la Cruz Fernández
• Directores de la Tesis: Teresa Gonzalez Gallego (dir. tes.), Carmen Valenzuela Miranda (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Lisardo Boscá (presid.), Rubén Vicente García (secret.), Teresa Giraldez Fernandez (voc.), Antonio Rodríguez Artalejo (voc.), Ángel Luis Cogolludo Torralba (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Texto completo no disponible (Saber más ...)
• Resumen
  • español

    Resumen Los canales de potasio dependientes de voltaje (KV) son proteínas de membrana involucradas en diversos procesos fisiológicos y patológicos tales como la respuesta inmune y la función cardiovascular. Nuestro primer objetivo fue determinar el posible papel que los canales heterotetraméricos KV7.1/KV7.5 en músculo liso vascular. Para ello, estudiamos los niveles de expresión de ambos canales en diferentes miocitos vasculares. Se estudió la interacción de ambos canales tanto en un sistema de expresión heterólogo como en células nativas de aorta de rata. Los canales KV7.1 se localizan en dominios enriquecidos de lípidos en las membranas celulares. La presencia de canales KV7.5 modula su localización en estos dominios y por tanto su regulación fisiológica. En aquellos tejidos donde ambas isoformas están presentes, la localización de canales en membrana es fuera de las balsas lipídicas. Gracias a la técnica de patch-clamp se determinó que los canales KV7.1/KV7.5 eran canales funcionales. El resultado obtenido de la activación de los canales KV7.1/KV7.5 fueron corrientes fenotípicamente intermedias entre las obtenidas para cada uno de los canales por separado. Además, se demostró que, en presencia de subunidades reguladoras (KCNE1 Y KCNE3), los canales muestran características electrofisiológicas y farmacológicas propias. Retigabine es un fármaco (activador) ampliamente usado en el estudio de los canales KV7. Los canales KV7.1/KV7.5 son susceptibles de regulación por retigabine. Por último, se estudió la implicación de estos canales en la regulación del tono vascular. Se midió la capacidad de relajación de arterias coronarias, pre-constreñidas con bloqueantes de canales KV7. Se determinó que los canales KV7.1/KV7.5 están presentes en dichas arterias e involucrados en la regulación del tono vascular. Por otro lado, se estudió el canal KV7.1, junto con la subunidad reguladora, KCNE1, con la que forma una de las corrientes más importantes de la fase de repolarización del potencial de acción cardíaco (IKs). Se analizaron los efectos de la aplicación aguda y crónica de ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs), DHA y AA, en la corriente generada por KV7.1/KCNE1 expresados en células COS-7 mediante la técnica de patch-clamp. La perfusión aguda de DHA y AA aumentó la magnitud de la corriente de los canales KV7.1/KCNE1. DHA, pero no AA, hizo más lenta la cinética de activación de la corriente. Ambos, aceleraron la corriente de cierre de los canales. La aplicación crónica de estos compuestos, no aumentó la magnitud de la corriente. Sin embargo, DHA desplazó la dependencia de voltaje de los canales a valores más electronegativos del potencial de membrana, e hizo más rápida la cinética de activación y la cinética de cierre de los canales. La aplicación crónica de AA ralentizó la cinética de activación y aceleró la cinética de cierre. Además, DHA crónico disminuyó la expresión de KV7.1 pero no de KCNE1, e indujo una redistribución de KV7.1 en la membrana celular. El efecto producido por los ácidos grasos sobre los canales KV7.1/KCNE1, depende tanto de la naturaleza del compuesto, n-3 o n-6 AGPIs, como del modo de administración, agudo o crónico. Los mediadores lipídicos derivados de AGPIs n-6 y n-3, como lipoxinas y resolvinas (cuya producción aumenta tras la ingesta de aspirina), han surgido como nuevos y potentes agentes que regulan la inflamación aguda promoviendo la resolución. Los canales iónicos juegan un papel esencial en la fisiología de los macrófagos. Por ello, se estudió los efectos de estos derivados lipídicos tanto en macrófagos derivados de médula ósea (MDMO) cuya activación se relaciona con los canales KV1.3/KV1.5, como en los canales KV7.1/KCNE1 donde se habían previamente estudiado los efectos de los AGPIs. Las lipoxinas, pero no las resolvinas, revertieron la activación de los macrófagos inducida por el lipopolisacárido (LPS). Sin embargo, la resolvina D1 bloqueó de una manera mucho más potente los canales KV7.1/KCNE1.

  • English

    Abstract Voltage-dependent potassium channels are spanning-membrane integral proteins involved in several and diverse physiological and pathological processes such as immune response or cardiovascular function. The first goal of this study was to elucidate the role of KV7.1/KV7.5, as a heterotetramer complex, in vascular smooth muscle. To that end, we studied the expression levels of both channels in rat vascular myocytes, as well as their interaction in both a heterologous system and in aorta artery cells. KV7.1 channels targets lipid-enriched domains in plasma membrane. The presence of KV7.5 channels modulates KV7.1 channels-targeting and, indeed, their physiological regulation. In those tissues where KV7.1 channels are the only ones expressed, as in the heart, KV7.1 channels are targeting lipid rafts. However, when both isoforms are expressed together, as in aorta artery and cava vein, the distribution of both channels throughout the membrane changes. Using patch-clamp technique we demonstrated that KV7.1/KV7.5 channels were functional, and we studied their electrophysiological and pharmacological properties. The activation of the channels generated a phenotypically intermediate current, which properties were between both the homotetrameric channels alone. In addition, electrophysiological characteristics of the channels were studied in the presence of different regulatory subunits (KCNE1 and KCNE3). In the presence of regulatory subunits KV7.1/KV7.5 channels showed their own electrophysiological properties. Retigabine is an activator drug of KV7.2-7.5 channels. KV7.1/KV7.5 channels can be regulated by retigabine as KV7.5 channels. We studied the possible role of these channels in the control of the vascular tone. To that end, we measured the relaxant response of coronary arteries induced by retigabine in constricted arteries by different blockers of KV7 channels. We demonstrated that KV7.1/KV7.5 are involved in the control of the vascular tone. Otherwise, we studied the KV7 first member, the KV7.1 channel, with the KCNE1 regulatory subunit. Together, they form one of the most important current of the repolarization phase of the cardiac action potential (IKs). We analyzed, using the patch-clamp technique, the acute and chronic exposition of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), DHA and AA, in KV7.1/KCNE1 channels expressed in COS-7 cells. Also, in DHA analysis, we used western blot and isolation lipid rafts techniques. Acute DHA and AA exposition increased the magnitude of KV7.1/KCNE1 currents. DHA but not AA slowed the activation kinetics. However, both PUFAs accelerated the deactivation kinetics. Chronic exposition to these compounds did not modify the magnitude of the currents. However, DHA shifted the activation curve toward more negative membrane potentials and accelerated the activation and deactivation kinetics of the channels. On the contrary, AA slowed the activation whereas it accelerated the deactivation process. Chronic exposure to DHA, decreased the KV7.1 but not KCNE1 protein expression. Also, it induced a redistribution of KV7.1 channels in the plasma membrane. PUFAs effects on KV7.1/KCNE1 channels depends on both the compound’s chemical nature, n-3 or n-6 PUFAs, as well as the time of exposure, which might be acute or chronic. It has been described that enriched PUFAs diet has anti-inflammatory properties. Moreover, n-3 or n-6 PUFAs lipid-derived mediators such as lipoxins and resolvins (which levels are increased by the consumption of aspirin), have been emerged as potent anti-inflammatory agents that promote the resolution phase of the inflammation process. Ion channels, and specially potassium ion channels, play an essential role in macrophages physiology. Accordingly, we studied the lipid-derived mediators effects on both bone marrow derived macrophages (BMDM), which LPS-dependent activation are related with the increased of KV1.3/KV1.5 expression, and in KV7.1/KCNE1 channels where the PUFAs effects have been studied. Lipoxins, but not resolvins, could reverse the LPS-activated macrophages. However, resolvins KV7.1/KCNE1 block were much more potent.