Resumen de Taxonomía de hongos celomicetos de interés clínico

Nicomedes Miguel Antonio Valenzuela López

• El reino Fungi está constituido por una gran diversidad de organismos eucariotas cuyas células siempre están rodeadas de una pared celular compuesta de polisacáridos, heterótrofos (no fotosintéticos, de nutrición absortiva), mayoritariamente microscópicos, unicelulares (levaduras) o pluricelulares (hongos miceliares o filamentosos) y de distribución cosmopolita. Estos organismos desempeñan una importante labor medioambiental, reciclando la materia orgánica muerta. Muchos son de interés biotecnológico, debido a la producción de antibióticos y otras substancias de interés, o son empleados en alimentación humana, como es el caso de las setas.

  Los celomicetos son hongos mitospóricos (se multiplican y dispersan mediante la producción de esporas asexuales), cuyos propágulos de dispersión (conidios, mitosporas) son producidos dentro de cuerpos fructíferos (conidiomas). Estos hongos han sido agrupados tradicionalmente en dos órdenes (Melanconiales y Sphaeropsidales) dependiendo del tipo de cuerpos fructíferos producidos, los acérvulos y los picnidios.

  En las últimas tres décadas la micología médica ha dedicado un especial interés a los hongos patógenos oportunistas, los cuales ocasionan un amplio rango de patologías infecciosas, principalmente en individuos inmunocomprometidos, lo cual determina que dichas infecciones sean a menudo difíciles de tratar y, por dicho motivo, tengan una alta mortalidad asociada. A pesar de que los hongos celomicetos se aíslan con cierta frecuencia de especímenes clínicos, se desconoce la incidencia real de sus especies cómo agentes infecciosos para el hombre. Solo un estudio pormenorizado de un gran número de aislados, su correcta identificación y el establecimiento de patrones de sensibilidad antifúngica nos permitirá en el futuro realizar un diagnóstico más preciso de las infecciones causadas por este grupo de hongos y, a su vez, aplicar un tratamiento antifúngico eficaz, el cuál será decisivo para la supervivencia del paciente. Las especies de hongos celomicetos implicados en infecciones humanas pertenecen mayoritariamente a los géneros Colletotrichum, Lasiodiplodia, Medicopsis y Neoscytalidium. Sin embargo, el número de taxones reportados como patógenos oportunistas crece año tras año, de forma paralela a la incorporación de las técnicas moleculares en el laboratorio clínico empleadas para su identificación.

  Por lo antes expuesto, el objetivo general de la presente tesis doctoral es: - Determinar el espectro de especies y géneros de hongos celomicetos que producen infecciones oportunistas en humanos, contribuyendo al esclarecimiento de su taxonomía y filogenia, así como determinar sus patrones de sensibilidad antifúngica in vitro, con la finalidad de poder instaurar un tratamiento terapéutico eficaz.

  Por dicho motivo, los objetivos específicos son: 1. Caracterizar fenotípicamente un gran número de aislados clínicos de los hongos de interés.

  2. Obtener las secuencias nucleotídicas de la región ITS y de los dominios D1 y D3 del gen 28S del ARN ribosómico nuclear, y de fragmentos de otros genes estructurales (β-tubulina, factor de elongación 1-α, rpb2, etc.) de los aislados clínicos en estudio.

  3. Comparar los caracteres fenotípicos y genotípicos de los aislados clínicos con aquellos correspondientes a las cepas tipo o de referencia de hongos celomicetos previamente descritos, para establecer sus relaciones filogenéticas y su ubicación taxonómica, proponiendo una metodología eficaz para su correcta identificación.

  4. Determinar la sensibilidad in vitro de los aislados identificados frente a los antifúngicos existentes actualmente en el mercado.

  Metodología Cepas: Las cepas de origen clínico fueron facilitadas por los laboratorio de referencia: Fungus Testing Laboratory, University of Texas Health Science Center (UTHSC, San Antonio, EE.UU.), el Instituto Carlos III (Madrid, España) y el Institut Pasteur (París, Francia), respectivamente . Las cepas de referencia y/o tipo de las especies a estudiar se obtuvieron del Westerdijk Fungal Biodiversity Institute (CBS, Utrecht, Países Bajos).

  Estudio fenotípico: Los aislados se sembraron en agar harina de avena (OA), agar patata glucosa (PDA) y agar patata zanahoria (PCA), y se incubaron a 25ºC por 14 a 30 días (o más tiempo si era necesario). Se observaron y describieron sus características macroscópicas (tasa de crecimiento, color, aspecto y textura de las colonias) y microscópicas (presencia o ausencia de conidióforos, tipo y forma de las células conidiógenas, forma, apariencia, color, tamaño y organización de los conidios, presencia de clamidosporas u otras estructuras). También se realizaron pruebas de crecimiento a diferentes rangos de temperatura.

  Estudio molecular: Los aislados se sembraron en PDA tras 5-7 días de incubación a 25ºC, se les extrajo ADN total y se les amplificó las regiones genómicas de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con cebadores específicos para las regiones ribosomales ITS y los dominios D1-D3 del gen 28S rRNA (LSU), además de algunas porciones de genes estructurales como la beta-tubulina, actina, factor de elongación, etc. Los fragmentos obtenidos fueron purificados, secuenciados y analizados mediante programas bioinformáticos para la obtención de secuencias consenso (Seqman), alineamientos (MEGA 6.0) y construcción de árboles filogenéticos (Mega 6.0; PAUP, MrBayes) para establecer las relaciones genéticas entre los aislados estudiados y las cepas de referencia o tipo, a través de diferentes métodos estadísticos como la máxima parsimonia, maxima verosimililitud (ML, Maximum Likelihood) y/o el análisis bayesiano.

  Identificación: La identificación final de los aislados se realizó comparando las secuencias resultantes con aquellas procedentes de cepas tipos y/o de referencia, estableciendo los porcentajes de similitud genética entre ellas mediante la aplicación de programas informáticos (GeneDoc, Mega 6.0, etc.).

  Sensibilidad antifúngica: Se realizó la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) o concentración mínima eficaz (CME), según correspondía, mediante microdilución en caldo, utilizando el método de referencia estandarizado por el CLSI en su documento M38-A2.

  Conclusiones En el presente trabajo se ha realizado un estudio polifásico (morfológico, fisiológico y molecular) de un gran número de aislados de hongos celomicetos de origen (mayoritariamente) clínico, así como de un cierto número de aislados de origen ambiental provenientes de colecciones internacionales de cultivos microbianos, y de muestras de suelo y heces de animales herbívoros (aisladas durante el presente estudio), con la finalidad de clarificar su taxonomía y posición filogenética. Los resultados obtenidos, los que también incluyen el perfil de sensibilidad antifúngica de aquellas especies de hongos celomicetos más frecuentemente recuperadas de especímenes clínicos, se exponen a continuación:

  Del estudio de los aislados clínicos provenientes de los Estados Unidos de Norteamérica, así como de los aislados ambientales:

  1. Las 230 aislados procedentes del Fungus Testing Laboratory, University of Texas Health Science Center (UTHSC, EE.UU.) se distribuyeron en once órdenes diferentes: Botryosphaeriales, Capnodiales, Diaporthales, Glomerellales, Helotiales, Hypocreales, Hysteriales, Magnaporthales, Pleosporales, Valsariales y Xylariales, siendo el orden Pleosporales el que agrupó el mayor número de hongos celomicetos (n = 152, 66.1 %).

  2. A partir del estudio polifásico de 70 aislados UTHSC (identificados previamente como Phoma spp. o Pyrenochaeta spp.), 71 cepas de referencia o tipo del Westerdijk Fungal Biodiversity Institute (CBS, Países Bajos), un aislado del International Collection of Microorganisms from Plants (ICMP, Nueva Zelanda) y un aislado de la colección de microorganismos Facultad de Medicina de Reus (FMR, España), se propusieron cuatro nuevas familias, 13 nuevos géneros y 29 nuevas especies, con un total de 20 nuevas combinaciones y cuatro tipificaciones.

  3. El resto de los aislados (n = 82) del UTHSC, CBS (n = 24) y FMR (n = 2) se distribuyeron en 15 familias del orden Pleosporales, se proponen como potenciales nuevos taxones y que corresponden a un total de una nueva familia, 12 nuevos géneros y 30 nuevas especies, más cinco combinaciones nuevas.

  Del estudio de los aislados clínicos provenientes de dos laboratorios de referencia europeos (Instituto Carlos III, Madrid, España, y el Institut Pasteur, París, Francia: 1. Los 97 aislados clínicos provenientes de España (n = 46) y Francia (n = 51) se distribuyeron en cuatro órdenes diferentes: Botryosphaeriales, Diaporthales, Glomerellales y Pleosporales, siendo este último el más prevalente (n = 78; 81 %).

  2. Ocho pertenecieron a la especie Neocucurbitaria keratinophila, motivo por el cual se sospecha que es un patógeno emergente de distribución geográfica limitada (a España), motivo por el cual fueron caracterizadas tanto morfológica como molecularmente (mediante las secuencias nucleotídicas de los marcadores LSU, ITS, tub2 y rpb2), además de determinar su patrón de sensibilidad antifúngica in vitro.

  Del estudio de los aislados ambientales provenientes de España y otro aislado ambiental proveniente de Nueva Zelanda que se encuentran tanto nuestra colección FMR como en el CBS e ICMP se concluye lo siguiente:

  1. De un total de 20 aislados ambientales colectados en España más el aislado de Nueva Zelanda, se obtuvieron un género nuevo y cuatro nuevas especies para la ciencia, los cuales corresponden a los siguientes: Alfaria dactylis, Coniella heterospora, Pseudoascochyta novae-zelandiae, Pseudoascochyta pratensis.

  Del estudio de sensibilidad in vitro de diferentes géneros de hongos celomicetos frente a antifúngicos:

  1. La mayoría de los 139 aislados presentaron CMIs bajas frente a los antifúngicos ensayados.

  2. Los aislados de Colletotrichum spp. presentaron CMIs elevadas frente al itraconazol y el voriconazol, y en el caso de un aislado frente a la caspofungina y la micafungina.

  3. Los aislados de Didymella spp. presentaron CMIs elevadas frente a la anfotericina B, itraconazol, voriconazol, anidulafungina y caspofungina.

  4. Los aislados de Neoascochyta desmazieri presentaron CMIs elevadas solo frente al voriconazol.

  5. Los aislados de Neoscytalidium dimidiatum presentaron CMIs elevadas frente al voriconazol, itraconazol, caspofungina y micafungina.

  6. Los aislados de Medicopsis romeroi presentaron CMIs elevadas frente a la anfotericina B, itraconazol, caspofungina y micafungina.