Caracterización química y bioactividad de compuestos producidos por levaduras y derivados de la vid.
- Autores: Edwin Fernández Cruz
- Directores de la Tesis: Ana Belén Cerezo López (dir. tes.), María del Carmen García Parrilla (dir. tes.), Ana María Troncoso González (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Número de páginas: 271
- Tribunal Calificador de la Tesis: Albert Mas Barón (presid.), María Teresa Morales Millán (secret.), María Puy Portillo Baquedano (voc.), Peter Winterhalter (voc.), Raquel María Callejón Fernández (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Farmacia por la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
- español
En los últimos años, la melatonina ha sido identificada en diversas matrices alimentarias, principalmente de origen vegetal como frutas (uvas, fresas) y verduras (tomates, pimientos). Sin embargo, ha generado un notable interés el hecho de detectar melatonina en alimentos fermentados como el vino o la cerveza. Todo parece indicar que la presencia de esta molécula en alimentos fermentados está directamente relacionada con el metabolismo de las levaduras, especialmente del género Saccharomyces cerevisiae, durante los procesos fermentativos.
La melatonina es bien conocida en mamíferos como neurohormona sintetizada por la glándula pineal y su función principal es la de regular los ciclos circadianos de sueño/vigilia dependiendo de las condiciones de luz y oscuridad. Además, también ha mostrado otras propiedades bioactivas como molécula antioxidante, siendo una excelente captadora de especies reactivas de oxígeno. Por otro lado, ha sido también descrita en plantas y en microorganismos, aunque en este caso sus funciones no están completamente dilucidadas. La melatonina se forma a partir del aminóacido triptófano, que pertenece al grupo de aminoácidos aromáticos junto a la tirosina y la fenilalanina. Su proceso de formación en mamíferos contempla como intermediarios moléculas como el 5-hidroxitriptófano, la serotonina o la N-acetilserotonina. En plantas, la triptamina también puede formar parte de la ruta de formación de la melatonina en lugar del 5-hidroxitriptófano. Sin embargo, en microorganismos no está claramente definida su ruta metabólica de síntesis. En el caso de las levaduras, el metabolismo del triptófano produce asimismo el ácido indolacético y el triptofol, derivados de la ruta de Ehrlich. Las técnicas analíticas para cuantificar melatonina en fluidos biológicos y alimentos abarcan desde el radioinmunoensayo, en el que destaca la técnica ELISA, hasta las técnicas de cromatografía líquida de alta resolución con detectores de masas de última generación. El principal reto es poder detectar y cuantificar concentraciones a nivel de traza. Las primeras han demostrado ser eficaces en fluidos biológicos como el plasma o la saliva. No obstante, cuando se han aplicado a matrices alimentarias, los resultados han sido dispares, hecho motivado por posibles interferentes de la compleja matriz alimentaria que puedan reaccionan con los anticuerpos utilizados en el ELISA. Por ello, la Cromatografía Líquida de Alta Resolución ha mostrado ser la mejor alternativa para el análisis de melatonina y de otros compuestos derivados del aminoácido triptófano.
En un principio, se desarrollaron métodos de cromatografía líquida con detectores de fluorescencia, pero debido a las bajas concentraciones de la melatonina en alimentos fermentados, los límites de detección y cuantificación de estos detectores fueron insuficientes para la identificación inequívoca de esta molécula. En la actualidad, la cromatografía acoplada a espectrómetros de masas parece ser la más indicada para el estudio de la melatonina. Sin embargo, la mayor parte de métodos publicados solo contemplan el análisis de la melatonina de forma aislada, por lo que no permiten ofrecer una visión global sobre su posible vía de formación en alimentos fermentados. La presente Tesis Doctoral tiene como uno de sus objetivos desarrollar un método cromatográfico acoplado a espectrometría de masas para identificar simultáneamente diferentes compuestos derivados del metabolismo del triptófano y relacionados con la ruta de síntesis de la melatonina. Además, se contempla el estudio de la estabilidad de estas moléculas frente al almacenamiento prolongado para comprobar el posible efecto matriz. Asimismo, se realizan diferentes ensayos de fermentación alcohólica tanto en mostos sintéticos como naturales a fin de seleccionar las levaduras con mayor capacidad de producción de compuestos indólicos derivados del triptófano. A su vez, se analizaron cervezas comerciales para dilucidar si en otras matrices distintas al vino se detectaba la presencia de compuestos indólicos. Asimismo, se han realizado estudios de bioactividad de compuestos estilbenoides, derivados del aminoácido fenilalanina y presentes en raspones de la vid (Vitis vinífera).
Estos ensayos tienen como objetivo evaluar la capacidad de estos compuestos frente a la inhibición del proceso de angiogénesis, que en adultos está involucrado en la patogenia del cáncer y las enfermedades cardiovasculares, consideradas como las principales causas de muerte en el mundo, según los últimos datos de la OMS. Debido a que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es principal factor proangiogénico, la inhibición de VEGF es un mecanismo molecular plausible que demuestra una causa-efecto directa en la disminución del riesgo cardiovascular y de cáncer. Prueba del crucial rol de VEGF en la angiogénsis es el hecho de que ciertos fármacos frente al cáncer consisten en moléculas anti-VEGF, como el Avastin®. Sin embargo, debido al uso prolongado de las terapias anti-VEGF se han descrito serios efectos adversos, como hipertensión. Ciertos compuestos polifenólicos presentes en los alimentos como el galato de epicatequina, quercetina, entre otros, han demostrado poseer potencial anti-VEGF a la vez que activan la enzima óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS), responsable de la vasodilatación. Por tanto, se evaluó el potencial anti-VEGF de 12 compuestos de la familia de los estilbenos en una línea de células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC). Además, se determinó su efecto en la cascada de señalización intracelular, en concreto sobre las proteínas fosfolipasa gamma 1 (PLCγ1), responsable de la proliferación celular, la protein quinasa B (Akt) e eNOS. Los resultados más notables derivan del desarrollo de un método analítico validado que por primera vez identificaba simultáneamente nueve derivados del metabolismo del triptófano. Dicho método ha sido de utilidad para evaluar el posible efecto matriz de muestras fermentadas, dando por resultado que la cerveza es la matriz que sufre menos alteraciones en cuanto la composición de los compuestos indólicos, estableciendo como mejor temperatura de almacenamiento 4ºC. Las otras matrices probadas (vino, mosto sintético fermentado y extracto intracelular) fueron más inestables a lo largo del periodo de almacenamiento. Por otro lado, se confirmó la producción de melatonina y otros compuestos derivados del metabolismo del triptófano como la serotonina, el ácido 3-indolacético, triptofol y un ester etílico del triptófano durante la fermentación alcohólica de mostos sintéticos, resultando la cepa de levaduras Saccharomyces cerevisiae Aroma White la mayor productora de melatonina. Los resultados, además, fueron reproducibles en mostos de uva natural de distintas variedades de uva (Corredera, Chardonnay, Moscatel, Palomino Fino, Sauvignon Blanc, Tempranillo, Vijiriega), donde la levadura Aroma White volvió a ser la mayor productora de melatonina. A su vez, destaca la descripción por primera vez de uno de los intermediarios de la ruta de la melatonina, la N- cetilserotonina, en fermentaciones llevadas a cabo en mostos de la variedad Tempranillo. Además, se ha analizado el contenido de melatonina y otros compuestos indólicos en diferentes cervezas comerciales, entre los que destaca la identificación por primera vez de 5- hidroxitriptófano, N-acetilserotonina y ácido 3-indolacético. En cuanto a la bioactividad de estilbenos, se han seleccionado 5 compuestos (astringina, piceatanol, pallidol, ε- y ω-viniferina) capaces de inhibir VEGF (IC50 = 2,9-39,4 μM). Además, las dos viniferinas fueron capaces de inhibir PLCγ1 al mismo tiempo que activaron eNOS, por lo que cabría esperar que no presentaran el efecto hipertensivo asociado a los actuales fármacos anti-VEGF. Los resultados son sin duda de interés a fin de mejorar los procesos de vinificación para que estos compuestos de la vid y los sintetizados por las levaduras durante la fermentación estén presentes en el vino, dándole un valor añadido al producto final, y trasladando las prácticas a la fabricación de otras bebidas fermentadas como la cerveza.
- English
In recent years, melatonin has been identified in different foods, mainly from plant origin such us fruits (grapes, strawberries) and vegetables (tomatoes and peppers). However, the identification of melatonin in fermented foods as beer and wine has attracted an increasing interest in research. Literature data indicate that the presence of this molecule in fermented food is due to the yeast metabolism, especially from Saccharomyces cerevisiae, during fermentative process. Melatonin is a well-known neurohormone synthesized by the pineal gland of mammals. Its main function is related with circadian rhythms depending of light/darkness conditions. Besides, it has reported additional bioactive properties such as antioxidant, being an effective oxygen scavenger. On the other hand, it has also been described in plants and microorganism, although its role in both organism in not well elucidated. Melatonin is formed from the amino acid tryptophan that belongs to the aromatic amino acids groups. Mammal’s metabolism of tryptophan encompasses different secondary metabolites such as 5-hydroxytryptophan, serotonin and N-acetylserotonin. In plants, tryptamine can be included on the melatonin pathway instead of 5-hydroxytryptophan. However, the metabolic pathway that produce melatonin in microorganisms is not completely defined.
Nevertheless, amino acid catabolism by yeast known as the Ehrlich pathway mainly produces indole acetic acid and tryptophol. Analytical techniques to quantify melatonin in biological fluids and foodstuff is quite diverse, covering from radioimmunoassay, being ELISA the most representative, to high resolution liquid chromatographic techniques coupled to a high resolution mass spectrometer. The main challenge of these techniques is to improve the detection and quantification limits of these compounds. ELISA technique is well performed when biological fluids are analysed. Nevertheless, its application to foodstuffs has been less repeatable, maybe due to the presence of interference in the food matrix that can react with the ELISA antibodies. For this reason, High Resolution Liquid Chromatography has proved to be the best technique for the melatonin and derived tryptophan compounds analysis. At first, chromatographic methods with a fluorescence detector were used to determine melatonin in food. However, the low concentrations of melatonin presented in foods, and the limits of detection and quantitation of this detector make it ineffective to describe the presence of melatonin unequivocally. Nowadays, liquid chromatography coupled to mass spectrometers results the best option to study melatonin. However, most of the reported methods only analysed melatonin. Thus, they cannot bring to light to a fully view of the likely formation pathways in fermented foods. Therefore, one of the aims of the present doctoral thesis is to develop a chromatographic method couple to mass spectrometry that simultaneously identify different tryptophan derived compounds related with melatonin formation pathway. Additionally, the study of the compounds stability in different storage conditions was also included. Furthermore, fermentation experiments were performed in synthetic and natural must in order to find yeast with the best ability to synthesize indolic compounds derived from tryptophan. Eventually, commercial beers were analysed to dilucidate whether in other matrixes apart from wine indolic compounds are also produced. Moreover, the bioactivity of stilbenoids compounds derived from the amino acid phenylalanine and present in grapevine stalks of Vitis vinífera, was also study. These experiments have the aim of evaluate the potential ability of these compounds to inhibit angiogenesis. This physiological process is involved in the development of cancer and cardiovascular diseases in adult population. Both diseases are consider the world’s leading cause of death, according to the last data reported by the World Health Organisation. Since vascular endothelial growth factor (VEGF) is the main proangiogenic factor, its inhibition is a plausible molecular mechanism that shows a direct cause-effect for decreasing cardiovascular and cancer risk. One of the most remarkable proofs of VEGF role in angiogenesis is that some cancer treatments are based in an anti- VEGF drugs such as Avastin®, which is the most currently used. However, their lengthy treatment causes serious side effects, increasing the risk of hypertension. Certain polyphenols that are present in foods such as epillogatechin gallate and quercetin, among others, have proved a potential anti-VEGF activity, allowing the activation at the same time of the endothelial nitric oxide synthase, responsible of vasodilation. Thus, anti-VEGF potential of twelve stilbenes was evaluated in human umbilical vein endothelial cells. In addition, the possible effect on the signalling intracellular downstream, particularly on phospholipase γ1 (PLC γ1, main responsible of cell proliferation), protein kinase B and eNOS was also studied.
Most remarkable results lead from the development and validation of an analytical method that identified simultaneously nine compounds derived from the amino acid tryptophan for the first time by UHPLC/HRMS technique in fermented synthetic must. The present method has been useful to evaluate the possible matrix effect of fermented samples, resulting beer as the matrix that caused less decrease of indolic compound composition and establishing a storage temperature of 4ºC as the best alternative of conservation.
On the other hand, melatonin and related compounds derived from tryptophan metabolism such as serotonin, indole acetic acid, tryptophol and ethyl ester of tryptophan was confirm during the alcoholic fermentation of synthetic must, being the S.cerevisiae Aroma White the most melatonin producer. Additionally, it was proved the reproducibility of results in natural must of different grape varieties (Corredera, Chardonnay, Moscatel, Palomino Fino, Sauvignon Blanc, Tempranillo, Vijiriega), where Aroma White proved again to be the highest melatonin producer. Moreover, for the first time N-acetylserotonin was quantified during the alcoholic fermentation of Tempranillo must. The analysis of indolic compounds in beers pinpoints the identification of 5-hydroxytryptophan, Nacetylserotonin and indole acetic acid in beers as a novelty. Regarding stilbenes bioactivity, astringin, piceatannol, pallidol, ε- and ω-viniferina inhibited VEGF activity (IC50 = 2.9-39.4 μM). In addition, both ε- and ω-viniferin were also able to inhibited PLCγ1, while activated eNOS, likely avoiding the side effects of hypertension, currently related with the anti-VEGF drugs treatment. With no doubt, present results are remarkable to improve wine-making process by enhancing the presence of stilbenes from grapevine and the indolic compounds derived from the amino acid tryptophan by yeast metabolism in wines during the alcoholic fermentation, giving an added value to the final product and trying to emulate this practices to the production of other fermented beverages such as beer.
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