Reconocimiento molecular entre GAGs y proteínas extracelulares.: Estudios estructurales mediante RMN y dinámica molecular.
- Autores: María José García Jiménez
- Directores de la Tesis: Pedro Manuel Nieto Mesa (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Número de páginas: 308
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Fernández-Bolaños Guzmán (presid.), Antonio Franconetti García (secret.), Juan Luis Asensio Alvarez (voc.), María Victoria Gómez Almagro (voc.), Ana Ardá Freire (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química por la Universidad de Sevilla
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
El objetivo principal desarrollado durante esta tesis doctoral ha sido el estudio de la interacción de factores de crecimiento como FGF-1, Midkina, Pleiotrofina y Lectinas tipo C como Languerina con diferentes GAGs (glicosaminoglicanos) de gran importancia debido a sus funciones en el organismo. Este estudio ha sido realizado mediante RMN y docking y si fuese posible CORCEMA-ST. Además, como parte de este estudio se ha incorporado la determinación de la estructura química de los GAGs en su forma libre y complejado lo que proporciona datos de la interacción proteína-ligando. Esto se ha llevado a cabo mediante técnicas de RMN y dinámica molecular. Los diferentes GAGs estudiados en esta tesis doctoral han sido trisacáridos de heparina en su interacción con el FGF-1 (factor de crecimiento para fibroblastos), tetrasacáridos de Sulfato de condroitrina e híbridos Sulfato de condroitrina/Sulfato de dermatano en su interacción con Midkina y Pleiotrofina (dos factores de crecimiento) y disacáridos miméticos de Heparina y Condroitrin sulfato en su interacción con Midkina. Además, se ha realizado un breve estudio de la estructura tridimensional de un hexasacárido de Heparina el cual presenta un grupo sulfato en su extremo no reductor y su interacción con la Langerina.
Interacción de GAGs derivados de Heparina con FGF-1 y Langerina: Primero, se llevó a cabo la caracterización inicial de los 8 trisacáridos derivados de Heparina mediante técnicas de RMN como 1D-TOCSY, 2D-NOESY y 2D-HSQC. El estudio de la interacción de estos trisacáridos con el FGF-1 fue realizado mediante experimentos de STD (Saturation Tranference Difusion) y NOESY transferido. En este caso, se mostró tal interacción entre ambas especies y que la estructura tridimensional del ligando libre era la misma que el ligando enlazado. Además, para obtener datos cinéticos se realizaron experimentos de T1 selectivo obteniendo los valores de las constantes de afinidad proteína-ligando indicando una afinidad bastante aceptable del orden de μM a pesar de la poca longitud que presentaban. También, se confirmó mediante docking que los trisacáridos se unen a la zona principal y secundaria del FGF-1 tal y como era de esperarse pero los trisacáridos que presentan menos grupos sulfato (sólo 2 en una cara) se orientan en otro sitio de la proteína lo que provoca una disminución en la afinidad pero un aumento en la saturación recibida por el ligando desde la proteína. Se comprobó la importancia del grupo sulfato en posición 6 del anillo de GlcN_A el cual era imprescindible para la interacción con el FGF-2. En este caso, se producía también interacción entre ambas especies pero se observaba que por ese grupo sulfato la saturación disminuía.
La última parte de este capítulo fue la caracterización de un hexasacárido de Heparina que presentaba un grupo sulfato en la posición 4 del extremo reductor. Tanto de forma experimental con las técnicas mencionadas como mediante una simulación de dinámica molecular de 500 ns no se modificó el anillo del extremo no reductor cuando se incorporó un grupo sulfato presentando una conformación de 4C1 y los anillos de IdoA su equilibrio conformacional entre 1C4 y 2SO. La interacción entre dicho hexasacárido y la Langerina fue estudiada mediante experimentos de STD, docking y CORCEMA-ST y se confirmó que esta interacción es independiente del Ca2+ ya que dicho hexasacárido se sitúa en una grieta de cargas positivas de los aminoácidos de la Langerina y no se coordina por el Ca2+ ya que en vez de presentar un grupo hidroxilo libre importante para esta interacción presenta el grupo sulfato impidiendo la coordinación por el Ca2+.
Interacción de tetrasacáridos y disacáridos de Sulfato de condroitrina, Sulfato de dermatano y miméticos con Midkina. Primero, se obtuvieron dichos productos de forma sintética en el grupo de investigación. Los tetrasacáridos consistían en tres series con diferente secuencia. Cada serie presentaba tetrasacáridos con un patrón normal de CS, y otros presentaban sustituciones bien por grupos bencilos y benzoilos o por grupos sulfato. Con esas dos modificaciones del esqueleto del carbohidrato se pretendía aumentar la interacción proteína-ligando. Los disacáridos se clasifican como miméticos derivados de Heparina (11 al 14) y de Condroitin sulfato (15 y 16) ya que se ha cambiado un anillo ácido (ácido idurónico o glucorónico) por un anillo de glucosa. Del estudio de los tetrasacáridos y disacáridos miméticos en su forma libre se llega a la conclusión que son estructuras lineales y muy estables ya que los anillos de GlcN, GalN y GlcA muestran conformación 4C1 como era de esperarse para anillos sin sustituir pero también muestran la misma conformación cuando los grupos hidroxilos son sustituidos por grupos bencilos o benzoatos. El anillo de IdoA presente en los tetrasacáridos híbridos, muestra un equilibrio conformacional o no en función de las sustituciones que el anillo presente. Así, cuando el anillo está persulfatado presenta una única conformación (compuesto 3), cuando presenta una sulfatación tipo E (compuesto 1) muestra un equilibrio conformacional y cuando está dibencilado (compuesto 2) muestra también sólo una conformación. Como era de esperarse, se refleja la flexibilidad de este anillo de IdoA en presencia de los diferentes grupos protectores. Los disacáridos al estar formados por anillo de GlcN, GalN y Glc (son muy rígidos) se vuelven a obtener la conformación esperada para ellos independientemente del patrón de sulfatación. Estos datos son obtenidos de forma experimenta mediante técnicas de RMN de las cuales se han obtenido valores de distancias interprotónicas y constantes de acoplamiento las cuales predicen las conclusiones mencionadas. Para la realización de las simulaciones de las dinámicas moleculares para todos los GAGs ya mencionados, se necesitó crear residuos nuevos. Para ellos se creó hasta las cargas de cada residuo nuevo compensando la carga total del compuesto. A pesar de eso, cuando se realizaron dinámicas moleculares de 500 ns para cada uno de los compuestos, ocurría que para los anillos de GlcA en los tetrasacáridos y Glc en los disacáridos la conformación teórica cambiaba presentando un equilibrio conformacional mientras que los datos experimentales obtenidos por RMN reflejaban una única conformación. Para solventar esta diferencia se realizaron dinámicas moleculares con restricciones promediadas en el tiempo de 8 ns. Las restricciones fueron impuestas en función de la necesidad de mantener fijos los residuos. Así se obtuvieron simulaciones donde los anillos se mantenían constante a lo largo de toda la trayectoria cuyos valores de distancias y constantes de acoplamiento teóricas simulaban a las experimentales confirmando la estructura tridimensional para todos los ligandos libres. Si se analiza la interacción de los diferentes GAGs con la Midkina se concluyó mediante datos de STD y Polarización de Fluorescencia que se producía interacción para cada uno de ellos con dicha proteína pero los valores de constantes de disociación obtenidos para los complejos variaban en un rango bastante amplio (desde 1.3 μM a 300 μM) para GAGs con características muy similares. Esta diferencia dificultaba la obtención de valores cuantitativos de STD0 para los GAGs. Se obtuvo el mapa del epítopo de todos los GAGs los cuales indicaban un modo de unión lineal en el cual la Midkina debido a su flexibilidad rodeaba a los compuestos por lo que le pasaba saturación a prácticamente todos los protones. Esto fue corroborado por un docking de precisión simple y otro de precisión extra en el cual se obtuvieron muchas estructuras de los compuestos en el sitio central de la proteína, entre sus dos dominios. Además, se llevaron a cabo experimentos de NOESY tranferido y a partir del valor de σNOE se obtuvieron distancias experimentales para el ligando cuando forma parte del complejo. Esto reflejó que la estructura obtenida era igual que cuando el ligando se encontraba de forma libre indicando la gran estabilidad de estos productos.
Interacción de los tetrasacáridos 1, 7, 10, 2, 5 y 8 con la Pleiotrofina. En este capítulo sólo se estudió la estructura del complejo ya que la estructura de los ligandos libres se determinó en el capítulo anterior. Este estudio fue realizado mediante técnicas de RMN como STD y NOESY transferido por similitud con el anterior. En este caso, al igual que con la Midkina, los tetrasacáridos presentan interacción con la proteína indicando un modo de unión lineal en el interior de la proteína, ya que no se pudieron obtener diferencias entre ellos mediante esta técnica.
